評估無血清培養子宮內膜間充質干細胞的可行性

康 康，王藹明，尹善德，趙 勇，王明凱，黃紹敏解放軍醫學院，北京 00853；海軍總醫院 婦產科，北京 00048

評估無血清培養子宮內膜間充質干細胞的可行性

康 康1,2，王藹明1,2，尹善德2，趙 勇2，王明凱2，黃紹敏1
1解放軍醫學院，北京 100853；2海軍總醫院 婦產科，北京 100048

目的使用無血清培養基體外分離擴增子宮內膜間充質干細胞，研究其生物學特性。方法比較在無血清培養基中和含10%胎牛血清培養基中子宮內膜間充質干細胞細胞形態細胞表型、增殖能力、細胞活率和分化能力等生物學特性。結果無血清培養基和有血清培養基培養的子宮內膜間充質干細胞形態相似，但是前者呈明顯的漩渦狀生長，更加細長，立體感更強；無血清和有血清培養的子宮內膜間充質干細胞表面標記物均呈陽性；無血清培養的子宮內膜間充質干細胞細胞活率更高、細胞增殖能力更強。結論無血清培養基能夠在體外擴增子宮內膜間充質干細胞，并使其生物學特性(細胞增殖，細胞活率)優于胎牛血清培養的子宮內膜間充質干細胞，且分化能力無改變，可以取代胎牛血清用于細胞治療，避免有血清培養的干細胞治療引起的人畜共患病及免疫原性反應。

子宮內膜間充質干細胞；細胞增殖；細胞周期；分化

子宮內膜組織是一種高度再生的組織，在女性育齡期經歷超過400次的生長、分化和脫落[1]。子宮內膜在每個月經周期內可以增長約7 mm，其重塑能力是其他器官不能比擬的[2]。子宮內膜來源的間充質干細胞是細胞治療中非常有前景的無創來源。子宮內膜干細胞(endometrium-derived stem cells，EnSCs)首次于2004年從子宮內膜組織中分離出來，包括上皮干細胞、間充質干細胞、側群細胞、其中間充質干細胞應用最為廣泛，越來越多的證據表明，子宮內膜間充質干細胞(endometriumderived mesenchymal stem cells，EnMSCs)可以應用于再生醫學，其可以作為免疫調節劑以減輕炎癥，影響組織再生中血管的生成，也能誘導成為多能干細胞[3]。目前，關于EnMSCs培養和分離均是應用胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)作為營養來源，FBS成分尚未明確，且有含阮病毒的風險，據文獻報道，市售FBS 20% ～ 50%都含有病毒。除此之外，經FBS培養出來的干細胞內含有牛血清蛋白，可以使受者體內產生抗牛蛋白抗體，從而引起免疫反應，進而導致干細胞治療作用下降甚至失效。因此，發現一種高效的培養基，將干細胞的再生和分化能力保持高效，同時能夠最小化疾病的傳播風險，勢在必行[4]。目前，無血清培養基已經應用于骨髓間充質干細胞[5-6]、臍帶間充質干細胞[7-8]和脂肪間充質干細胞[9-10]，但是應用于子宮內膜間充質干細胞至今未見報道。我們用無血清培養基培養EnMSCs，從形態、增殖、分化以及表面標記物的活率來判斷無血清培養基是否可以應用于子宮內膜間充質干細胞的培養。

材料和方法

1 樣品來源 子宮內膜標本取自海軍總醫院2014年1 - 6月因子宮肌瘤、CINⅢ、宮頸癌而行子宮切除術的10位患者，均為育齡期女性，年齡31 ～50歲，術前3個月未服用過激素類藥物。組織均取自遠離患處，標本包含5 mm肌層的子宮內膜全層，獲取子宮內膜組織后，立即用無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗，置入10 ml無菌冰冷IMDM培養液(含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml)中，1 h內送京蒙高科干細胞實驗室培養[11]。所有子宮內膜均經病理檢查，排除子宮內膜增生癥、子宮內膜炎性病變、子宮內膜惡性病變等，且證實為增殖期或分泌期子宮內膜。標本留取經醫院倫理委員會批準，征得患者同意并簽署知情同意書。

2 試劑與儀器 IMDM培養基及試劑購于Gibico公司，MesenCult-XF購于Stem cell公司，CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABC-FITC全部購于BD公司。CCK-8試劑盒購于Dojindo公司。

3 細胞的原代培養 樣本送至實驗室后，在平衡鹽溶液中反復洗滌至去除紅細胞，將標本剪成5 mm3小塊，置于50 ml離心管中，加入5 ～ 10 ml濃度為0.25%的胰酶，于37℃水浴箱中消化30 min，10 mg/ml胰酶抑制劑中和胰酶活性。以2 000 r/min離心8 min，并用0.9%氯化鈉注射液清洗兩次，加入5 ～ 10 ml濃度為0.1%的膠原酶Ⅰ消化1 h，以1 500 r/min離心8 min，并清洗兩次，置于37℃，體積分數為5% CO2飽和濕度培養箱內培養，無血清培養體系(serum-free medium，SFM)為化學成分明確的商用無動物源成分的培養基，有血清培養體系(serumcontaining medium，SCM)含有10%的IMDM。72 h后更換培養基，之后每周更換2次。子宮內膜間充質干細胞于每一代傳代前由倒置顯微鏡進行拍照記錄。

4 EnMSCs流式細胞分析 細胞培養至第3代時分別進行免疫表型分析，鑒定所培養的細胞為間充質干細胞。用0.125%胰酶EDTA鈉溶液消化采集細胞，離心，棄去上清，用PBS以1×106的密度重懸，分別向預加好抗體CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABCFITC的FALCON管各加100μl細胞懸液，Mouse lgG1-FITC，Mouse lgG1-APC，Mouse lgG1-PE，Mouse lgG1-PercP做陰性對照。在3 h內上機檢測。EnMSCs細胞活率測定用0.125%胰酶EDTA鈉溶液消化采集細胞，1 500 r/min，5 min，離心，棄上清，7-AAD抗體加2μl/test，立即上機檢測。

5 EnMSCs細胞生長曲線測定 將第3代細胞分別以1 000/孔的密度接種到96孔板中，重復種植4個96孔板，分別檢測1 ～ 8 d細胞的增殖，并設置空白對照組，450 nm條件下檢測吸光度值。用酶標儀檢測，以時間為橫坐標，每組細胞平均吸光度為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。

6 EnMSCs成脂、成骨、成軟骨誘導分化 1)成脂分化取第3代細胞，3×104/孔接種于12孔板中。待細胞達到70% ～ 80%融合時，分別吸去培養基，加入成脂分化培養基，每隔2 ～ 3 d更換新鮮的成脂分化培養基。分化誘導3周后，進行油紅O油滴染色。成脂分化培養基在含IMDM培養基中補充有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、12 mmol/L L-谷氨酰胺、10 μmol/L胰島素(Sigma公司)、200 μmol/L 吲哚美辛(Sigma公司)、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，Sigma公司)。2)成骨分化取第3代細胞，3×104/孔接種于12孔板中。待細胞達到70% ～ 80%融合時，分別吸去培養基，加入成骨分化培養基，每隔2 ～ 3 d換液新鮮的成脂分化培養基。分化誘導3周后，用茜素紅進行油滴染色。成骨分化培養基低糖IMDM培養基中補充有10%胎牛血清、100 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鹽和100mmol/L地塞米松(Sigma公司)。3)成軟骨分化取第3代細胞，將P3代細胞按照5×105/ml的量加入成軟骨分化培養基重懸細胞，吸取10μl滴到6孔板上，放置24 h，24 h后加入新鮮的誘導分化培養基，分化誘導3周后，用阿利信藍染色。成軟骨分化培養基IMDM培養基中補充有10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、2 ml ITS和10 ng/ml TGF-β3(Sigma公司)。7 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行數據處理與統計分析，計量資料用表示。組間差異采用雙尾t檢驗和方差分析測試進行統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 EnMSCs貼壁細胞的形態及傳代 子宮內膜細胞分別用SFM和SCM接種24 ～ 72 h后貼壁，倒置顯微鏡下觀察呈現梭形；72 h后全量換液去除未貼壁的組織和細胞，此時細胞多呈長梭形和紡錘形，此后貼壁細胞迅速增殖，細胞集落明顯增大、增多。經過傳代，細胞逐漸表現為均一的長梭形。SFM接種的EnMSCs與SCM接種的EnMSCs相比，形態相似，但是前者呈明顯的漩渦狀生長，立體感更強。見圖1。

2 EnMSCs間充質干細胞免疫表型流式細胞儀檢測結果顯示，CD90、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC、CD13、CD29、CD44均呈陽性表達，CD34、CD45、CD14、HLA-DR、CD19呈陰性表達。見圖2。

3 EnMSCs細胞活率EnMSCs細胞活率流式 細胞儀檢測結果表明，SFM體系培養的EnMSCs成活細胞數目為94.27%±2.43% (n=5)，SCM體系培養的EnMSCs成活細胞數目為92.65%±2.92% (n=5)。SFM體系培養的EnMSCs細胞活率較高(P＜0.05)。見圖3。

4 EnMSCs細胞增殖和倍增時間 細胞貼壁后開始生長，1 ～ 2 d生長比較慢，于3 ～5 d進入對數期，6 ～ 8 d進入平臺期，根據吸光度值繪制的生長曲線呈“S”形，有明顯的滯留期，對數生長期及平臺期。SFM與SCM體系比較，1 ～ 2 d吸光度值無統計學差異(P＞0.05)，3 ～ 8 d SFM的吸光度值明顯優于SCM(P＜0.05)，表明經SFM培養的EnMSCs增殖能力更強，細胞生長狀況更好。見圖4。

5 EnMSCs成脂、成骨、成軟骨誘導分化1)成脂分化兩種培養基擴增的EnMSCs成脂誘導分化21 d并經油紅O染色后，倒置顯微鏡下觀察到細胞質中充滿紅色的油滴，提示細胞已經分化呈脂肪細胞。2)成骨分化EnMSCs經成骨誘導分化21 d后，運用茜素紅進行鈣化結節染色，可見致密生長的細胞中散在出現大小不一的橘紅色礦化結節。染色結果顯示兩種培養基擴增的EnMSCs均有成骨分化能力。3)成軟骨分化EnMSCs經成軟骨誘導分化21 d后，阿利辛藍染色可見細胞呈亮綠色，提示兩種培養體系培養出的細胞均能有成軟骨分化能力。見圖5。

圖 1 無血清培養條件下子宮內膜間充質干細胞(左)；有血清條件下子宮內膜間充質干細胞(右)(×100)Fig. 1 EnMSCs in SFM (left) and in SCM (right)(×100 magnification)

圖 2 無血清和有血清子宮內膜間充質干細胞表面標記物表達對比Fig. 2 Expression of cell surface markers of EnMSCs cultivated in SCM and SFM

圖 3 有血清培養條件下子宮內膜間充質干細胞活率的柱狀圖(左)，有血清條件下子宮內膜間充質干細胞的柱狀圖(右)Fig. 3 Histogram of cell viability in cultured EnMSCs in SFM detected by flow cytometry (left), histogram of cell viability in cultured EnMSCs in SCM detected by flow cytometry (right)

圖 4 無血清和有血清條件下子宮內膜間充質干細胞的生長曲線Fig. 4 Growth curve of EnMSCs in SFM and SCM

討 論

EnMSCs是一個極具吸引力的干細胞再生治療來源，其主要優勢是非侵入性獲得，是一種穩定的自體干細胞來源，且其易于擴展。迄今為止，EnMSCs已經應用于多種臨床試驗以及一些小動物的研究，將EnMSCs移植到肌營養不良小鼠的骨骼肌中，可以觀察到其對肌肉有一定的修復作用[12]；EnMSCs具有分化成平滑肌細胞的能力，已被嘗試應用于膀胱壁的重建[13]。也有研究將EnMSCs和骨髓間充質干細胞分別移植到心肌梗死鼠模型的心臟內，可以觀察到移植EnMSCs鼠的心臟梗死面積更小[14]。

圖 5 無血清培養基成脂、成骨、成軟骨誘導分化(左)，右圖為無血清培養基成脂、成骨、成軟骨誘導分化(右)(×100)Fig. 5 Adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiations of EnMSCs in SFM (left); Adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiations of EnMSCs in SCM (right)

目前，對于EnMSCs培養主要用合成細胞培養基，一般會在培養基中加入5% ～10%的胎牛血清[15-16]，這對培養產物的分離、純化和檢測會帶來一定的不便，在細胞的使用上也會帶來病毒和免疫的隱患。并且血清的成分是未知的，變化是莫測的，已被報道可能影響再生能力[17]。而無血清培養基組分穩定，性能一致性高，培養細胞科研評估精確，對培養細胞影響小，不含有絲分裂原抑制劑及其他生長抑制物質，可以促進細胞增殖；降低病毒、真菌、支原體等微生物污染的可能性等。然而，我國無血清培養的應用遠遠落后于國外，無血清培養基的來源主要依賴于國外產品，成本較高，應用也較少，至今未見關于應用無血清培養基培養子宮內膜間充質干細胞的報道。EnMSCs應用于人體的安全性備受關注。如何安全有效地擴展EnMSCs成為了亟需解決的問題。為了使子宮內膜間充質干細胞從基礎研究走向臨床應用，必須應用無血清培養體系。

本研究中，SFM培養的EnMSCs克隆團細胞排列緊密，形似鳥巢，呈明顯漩渦狀，表明所培養的細胞具有形成克隆的能力，符合EnMSCs的形態特征。從SFM和SCM培養條件下增殖能力可以看出，SFM培養條件下的EnMSCs在細胞適應期增殖能力稍差于SCM體系培養的EnMSCs，但是在細胞適應后，SFM體系培養的EnMSCs表現出更強的增殖能力。據一些文獻報道，低密度的干細胞在SFM體系擴增困難，但是當細胞擴增到一定密度，由于干細胞自身能夠分泌多種生長因子，可以促進細胞的增殖，EnMSCs能夠快速擴增，且擴增能力優于SCM。免疫表型是鑒定MSCs的一種重要的方法，流式細胞儀檢測結果顯示，CD90、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC、CD13、CD29、CD44均呈陽性表達，CD34、CD45、CD14、HLA-DR、CD19呈陰性表達，證明此細胞非造血干細胞來源，均與文獻描述一致[17]。經細胞活率鑒定，SFM體系培養的EnMSCs細胞活率更高，表明經SFM培養的干細胞更適用于干細胞的治療，穩定性更強。經成脂、成骨、成軟骨誘導分化培養，SFM培養的EnMSCs具有良好的成脂、成骨誘導分化能力，上述特征符合間充質干細胞的鑒定標準[14]。

綜上所述，本實驗證明無血清培養基可以培養出子宮內膜間充質干細胞，且分化能力并未受到影響，無血清培養基子宮內膜間充質干細胞代替傳統的動物血清培養子宮內膜間充質干細胞是可行的。

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Feasibility of serum-free medium in cultivating endometrium-derived mesenchymal stem cell

KANG Kang1,2, WANG Aiming1,2, YIN Shande2, ZHAO Yong2, WANG Mingkai2, HUANG Shaomin1
1Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China;2Department of Obstetrics & Gynecology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China.

WANG Aiming. Email: one_army@sina.com

ObjectiveTo dissect and amplify the endometrium-derived mesenchymal stem cells (EnMSCs) in serum-free medium (SFM) in vitro and assess their bionomics.MethodsBionomics of EnMSCs in SFM and serum-containing (fetal bovine serum) medium (SCM), such as morphology, phenotype, proliferative activity, cell viability and differentiation capability, were compared.ResultsSimilar cell morphology was shown within EnMSCs cultivated both in SFM and SCM, while the EnMSCs cultured in SFM showed obvious swirling growth and stronger three-dimensional effect, which was more slender. Surface markers of EnMSCs cultivated both in SFM and SCM were all positive. Cell viability and cell proliferation were higher in SFM than in SCM.ConclusionAccording to the results of the present study, we can conclude that EnMSCs can be cultivated in SFM with no changes in their differentiating capacity in vitro, and their bionomics (proliferation and cell viability) are better performed than those cultivated in SCM. Therefore, SFM can be used in cell therapy instead of fetal bovine serum. This finding gives us a hope for future cell therapy studies and trials with little concern about zoonotic infections or immunological reaction.

endometrium-derived mesenchymal stem cell; cell proliferation; cell cycle; differentiation

R 394.26

A

2095-5227(2015)06-0563-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.06.011

時間：2015-03-13 15:42

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150313.1542.003.html

2014-10-21

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAI32B05)；國家自然科學基金項目(81000245；81370703)；全軍后勤科研課題(CHJ 13J012)

Supported by the National Key Technology R&D Program of the Ministry of Science and Technology of People's Republic of China(2012BAI32B05); National Natural Science Foundation of China(81000245; 81370703); Scientific research Program of General Logistics Department of PLA(CHJ 13J012)

康康，女，在讀碩士，醫師。研究方向：生殖內分泌與輔助生殖。Email: kangtingting1988@126.com

王藹明，女，博士，主任醫師。Email: one_army@sina. com