解整合素-金屬蛋白酶17在肺泡上皮細胞間質轉化中的作用研究

周玲玲，劉敬禹

遼寧醫學院附屬第三醫院 呼吸科，遼寧錦州 121000

解整合素-金屬蛋白酶17在肺泡上皮細胞間質轉化中的作用研究

周玲玲，劉敬禹

遼寧醫學院附屬第三醫院 呼吸科，遼寧錦州 121000

目的探討解整合素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM 17)過表達和抑制在轉化生長因子-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)介導的A549細胞上皮向間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)過程中的作用，以進一步揭示肺纖維化的機制。方法將A549細胞分為空白對照組、TGF-β1組、PMA(ADAM 17激活劑)組和TNF484(ADAM 17抑制劑)組。各組細胞培養36 h后，應用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態，Real-time PCR和Western blotting分別檢測ADAM 17、上皮及間質細胞標記物在mRNA和蛋白水平上的表達情況。結果鏡下觀察發現未誘導的A549細胞呈鵝卵石形態，排列比較緊密；經TGF-β1誘導后，細胞形態伸長，出現偽足，排列較松散，細胞與細胞之間的緊密連接消失。Real-time PCR和Western blotting檢測結果均顯示ADAM 17在PMA組高表達，而在TNF484組低表達，差異有統計學意義；上皮細胞標記物E-cadherin在空白對照組和TNF484組高表達，間質細胞標記物Vimentin在TGF-β1組和PMA組高表達，差異同樣有統計學意義。結論ADAM 17的過表達有助于TGF-β1介導的A549細胞EMT進程，提示ADAM 17可作為肺纖維化的標記物之一。

上皮細胞間質轉化；解整合素-金屬蛋白酶17；肺纖維化

特發性肺纖維化是最常見的肺間質疾病，也是肺間質纖維化的主要原因，多數肺間質疾病病因不明，其發病機制目前也未完全闡明。肺泡上皮細胞通過上皮-間質轉化(epithelial-tomesenchymal transition，EMT)作為發病的促動因素，已得到學者們的廣泛關注[1-2]。EMT是一種完全分化的上皮細胞經歷細胞表型改變轉化成完全分化的間質細胞的過程，通常轉化成成纖維細胞和肌纖維母細胞[3]，參與多種器官的纖維化，包括肺和腎等[4-5]。解整合素-金屬蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM 17)屬于ADAMs家族成員之一，又稱腫瘤壞死因子α轉化酶，在多種跨膜蛋白分子(如腫瘤壞死因子α、表皮生長因子等)胞外域的剪切脫落過程中起重要作用[6]，參與炎癥和多種增生型疾病的進程，與腎纖維化和其他慢性腎疾病有關[7-8]。因此，推測ADAM 17可能作用于EMT過程并參與肺纖維化。為此，本研究應用轉化生長因子-β1(transforming growthfactor-beta 1，TGF-β1)誘導A549細胞發生EMT，添加PMA(ADAM 17激活劑)或TNF484(ADAM 17抑制劑)，Real-time PCR和Western blotting分別檢測ADAM 17、上皮(E-cadherin)及間質(Vimentin)細胞標記物在mRNA和蛋白水平上的表達情況，以闡明ADAM 17在EMT過程中的作用。

材料和方法

1 主要試劑 A549細胞株購于中國典型培養物保藏中心，RPMI 1640培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和胰蛋白酶購于Hyclone公司，重組人TGF-β1購自R&D公司，PMA和TNF484購自Sigma公司，兔抗ADAM 17、E-cadherin和Vimentin多克隆抗體購自Santa Cruz公司，RNAiso Plus、DNaseⅠ、PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ購于TaKaRa公司。

2 A549細胞的培養與誘導 A549細胞用含10% FBS的RPMI 1640培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養，每3～4 d換1次液，待細胞達到80%融合后，用0.25%胰酶和0.02% EDTA消化，收集細胞傳代。應用TGF-β1誘導細胞發生EMT，TGF-β1組培養基中僅添加5 ng/ml TGF-β1，PMA組和TNF484組培養基中除添加5 ng/ml TGF-β1外，分別再添加100 ng/ml PMA和TNF 484。培養36 h后，應用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態。

3 Real-time PCR檢測ADAM 17、上皮及間質細胞標記物的表達 取培養36 h后的各組細胞，分別加入RNAiso Plus提取總RNA，常規DNaseⅠ消化，瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，紫外分光光度計檢測純度和濃度，用RNase-free水稀釋為1 μg/ μl，按照TaKaRa反轉錄試劑盒(PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit)說明進行反轉錄，得到的cDNA樣品稀釋4倍，加入SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ和檢測引物(表1)，以GAPDH為內參基因，在Chromo 4?多色實時定量PCR儀(Biorad)上進行40個循環的PCR反應，應用Opticon-3軟件對反應結果進行定量分析。每次定量分析檢測樣品設置3個重復，以3批樣品進行獨立表達分析。

4 Western blotting檢測ADAM 17、上皮及間質細胞標記物的蛋白表達量 取培養36 h后的各組細胞，分別加入RIPA裂解液超聲破碎，4℃，12 000× g離心25 min，取上清，用BCA法測定蛋白含量。取樣進行SDS-PAGE分離后，轉膜，經4% BSA封閉1 h；加入一抗(1∶200稀釋)，4℃過夜；加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體(1∶1 000稀釋)，4℃搖床孵育1 h。采用UVP全自動凝膠成像系統ECL發光顯影，以β-actin作為內參。

5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件處理數據，統計資料以±s表示，組間比較進行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

結 果

1 光鏡下細胞形態學觀察 未誘導的A549細胞呈鵝卵石形態，排列比較緊密(圖1A)；經TGF-β1誘導后，細胞形態伸長，出現偽足，排列較松散，細胞與細胞之間的緊密連接消失(圖1B)；添加ADAM 17激活劑培養的細胞均勻分布，呈長梭形，出現典型的纖維細胞形態(圖1C)；而添加ADAM 17抑制劑的細胞僅有少部分呈現間質細胞形態，排列仍較緊密，上皮性明顯(圖1D)。

2 ADAM 17、E-cadherin和Vimentin mRNA的表達量 Real-time PCR結果顯示，如果將空白對照組ADAM 17 mRNA的表達量設定為1，則PMA組是空白對照組的(2.061±0.287)倍，而TNF484組是空白對照組的(0.634±0.172)倍，差異有統計學意義。同樣，如果將空白對照組E-cadherin mRNA的表達量設定為1，則TGF-β1組是空白對照組的(0.435±0.141)倍，而PMA組是空白對照組的(0.213±0.097)倍，差異有統計學意義。如果將TGF-β1組也就是陽性對照組Vimentin mRNA的表達量設定為1，則空白對照組和TNF484組分別是陽性對照組的(0.124±0.035)倍和(0.397±0.126)倍，而PMA組是陽性對照組的(1.982±0.225)倍，差異有統計學意義(圖2)。結果表明，ADAM 17的過表達有助于TGF-β1介導的A549細胞EMT進程。

3 ADAM 17、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達量 Western blotting檢測結果顯示，ADAM 17蛋白表達量在PMA組最高，在TNF484組最低，表明ADAM 17激動劑和抑制劑的效果明顯。上皮細胞標記物E-cadherin蛋白在空白對照組和TNF484組高表達，相反，間質細胞標記物Vimentin蛋白在TGF-β1組和PMA組高表達(圖3)，這就直觀地解釋了ADAM 17的過表達和抑制分別對A549細胞EMT進程的促進和削弱，與Real-time PCR結果相吻合。

圖 1 光鏡下A549細胞形態(×200)Fig. 1 A549 cell morphology detected by light microscopy (×200)

圖 2 ADAM 17、 E-cadherin和Vimentin mRNAs在各處理組中的相對表達水平Fig. 2 Relative expression level of ADAM 17, E-cadherin andVimentin mRNAs in all groups

圖 3 ADAM 17、 E-cadherin和Vimentin蛋白在各處理組中的表達水平Fig. 3 Expression level of ADAM 17, E-cadherin and Vimentin proteins in all groups

討 論

特發性肺纖維化肺實質纖維灶內間充質細胞主要包括成纖維細胞和肌纖維母細胞，這些細胞大量增生并伴隨著細胞外基質的沉積。但是，對于纖維灶具體的形成機制和細胞來源目前仍不清楚，主要認為先有肺泡上皮細胞的損傷而后出現纖維灶，推測肺泡上皮細胞除了通過自身的損傷與修復反應以外，由誘導或促進損傷的肺泡上皮細胞通過EMT過程發生轉化亦起重要作用[9]。發生EMT轉化的細胞可促進纖維灶的增生和發展，并產生大量的細胞外基質。TGF-β1是肺纖維化的關鍵性細胞因子，能刺激未成熟成纖維細胞生長，并促使組織的成纖維細胞聚集、擴散和分化[10-11]。TGF-β1能誘導和促進膠原蛋白的產生和沉積，通過自分泌或旁分泌作用，促進細胞增殖和細胞外基質沉積[12]。本研究應用TGF-β1誘導A549細胞，發現呈鵝卵石形態、排列較緊密的A549細胞誘導后形態伸長，排列較松散，細胞與細胞之間的緊密連接消失；Real-time PCR和Western blotting結果顯示，誘導后上皮細胞標記物E-cadherin顯著降低，而間質細胞標記物Vimentin明顯升高，這表明TGF-β1成功誘導A549細胞發生EMT過程。

ADAM 17作為機體正常發育必不可少的細胞因子，其在炎癥中也發揮重要作用，主要通過TNF-α的脫落，細胞黏附分子穿過血管壁引發白細胞遷移[13]。ADAM17參與表皮生長因子受體胞外域的脫落，引發下游級聯反應，導致細胞增殖、遷移或凋亡[14]。ADAM17與TGF-α共同存在于腎纖維化中，對于人類腎細胞ADAM17可通過促進TGF-α脫落而發揮致纖維化的作用[15]。本研究在TGF-β1誘導A549細胞過程中過表達和抑制ADAM17，形態學發現添加ADAM 17激活劑培養的細胞呈長梭形，出現典型的纖維細胞形態；而添加ADAM 17抑制劑的細胞僅有少部分呈現間質細胞形態，排列仍較緊密，上皮性明顯。Realtime PCR和Western blotting結果顯示，TNF484組高表達E-cadherin，而PMA組高表達Vimentin，表明ADAM 17的過表達有助于TGF-β1介導的A549細胞EMT進程，提示ADAM 17可作為肺纖維化的標記物之一。

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Role of ADAM17 during epithelial - mesenchymal transition in human lung alveolar epithelial cells

ZHOU Lingling, LIU Jingyu
Department of Respiratory, The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

LIU Jingyu. Email: liujingyu0416@163.com

ObjectiveTo investigate the role of ADAM17 in epithelial - mesenchymal transition (EMT) of A549 cells and the mechanism underlying pulmonary fibrosis.MethodsA549 cells were equally divided into four groups: blank control group,TGF-β1-mediated group, PMA (the activator of ADAM 17) group and TNF484 (the inhibitor of ADAM17) group. A549 cells were cultured in vitro, cellular morphology changes after 36 h were observed by phase contrast microscope. The mRNA and protein expressions of ADAM17 and the markers of epithelial cell and mesenchymal cell were determined by Real-time PCR and Western blotting.ResultsA549 cells lined up tightly in the blank control group, however, after mediated by TGF-β1, the cells became spindle and loosen. Real-time PCR and Western blotting results showed that the expression of ADAM 17 were higher in PMA group and lower in TNF484 group than that in blank control group, which had significant difference. The high expression of E-cadherin in blank control group and TNF484 group and the high expression of Vimentin in TGF-β1-mediated group and PMA group were also of significant difference.ConclusionHigh expression of ADAM 17 contributes to the EMT of alveolar epithelial cells, which suggests that ADAM 17 can be one of fundamental mechanisms of pulmonary fibrosis.

epithelial-to-mesenchymal transition; a disintegrin and metalloproteinase-17; pulmonary fibrosis

R 329.28

A

2095-5227(2015)03-0272-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.03.019

時間：2014-11-20 15:18

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141120.1518.001.html

2014-09-09

周玲玲，女，碩士。研究方向：間質性肺病。Email: sui feng800sd@163.com

劉敬禹，男，博士，主任醫師，主任。Email: liujingyu04 16@163.com