野百合堿注射建立大鼠肺動脈高壓模型的方法

李松華，石仁華，朱 琴，史承勇，杜 賀，趙仙先，陳少萍，秦永文

第二軍醫大學，上海 2004331長海醫院心血管內科；2翔殷路干休所

野百合堿注射建立大鼠肺動脈高壓模型的方法

李松華1，石仁華1，朱 琴2，史承勇1，杜 賀1，趙仙先1，陳少萍1，秦永文1

第二軍醫大學，上海 2004331長海醫院心血管內科；2翔殷路干休所

目的探討野百合堿注射建立大鼠肺動脈高壓模型的方法和關鍵點。方法SPF級雄性SD大鼠30只，隨機分為實驗組和對照組各15只。實驗組大鼠頸背部皮下注射野百合堿50 mg/kg；對照組皮下注射0.9%氯化鈉注射液1 ml。3周后大鼠行右心導管檢查、病理檢查和免疫組化檢查。結果實驗組大鼠表現為進行性右心功能衰竭，死亡2只，平均肺動脈壓力、右心室收縮壓均明顯高于對照組[(40.05±1.78) mmHg vs (18.63±1.80) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，(62.99±2.03) mmHg vs (28.04±2.26) mmHg，P均＜0.05]。病理切片HE染色，實驗組大鼠肺血管中膜明顯增生，管腔狹窄，中膜管壁厚度百分比、中膜管腔面積百分比、右心室肥厚指數[RV/(LV+IVS)]均明顯大于對照組[(0.292±0.064) vs (0.106±0.026)、(0.0495±0.092) vs (0.200±0.045)、(0.473±0.041) vs (0.295±0.035)，P均＜0.05]。實驗組大鼠肺血管增殖細胞核抗原免疫組化IA值明顯高于對照組[(39.5±8.7) vs (18.5±5.3)，P＜0.05]。結論經頸背部皮下注射野百合堿建立大鼠肺動脈高壓動物模型是一種操作簡單、有效可靠的方法，把握幾個關鍵點可以提高建模成功率。

肺動脈高壓；大鼠；野百合堿；動物模型

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是一類以肺小動脈收縮、增殖與重構為主要特征，進而引起肺血管阻力進行性升高，最終導致右心功能衰竭的肺血管疾病。目前，肺動脈高壓尚缺乏有效的根治方法，是肺血管病的研究熱點。為了更好地研究其病因及發病機制，本實驗擬建立野百合堿注射建立大鼠肺動脈高壓的動物模型，并檢測其肺血管血流動力學及結構變化，探討這一動物模型構建過程中的關鍵點。

材料和方法

1 實驗動物及分組 SPF級健康雄性SD大鼠30只，由第二軍醫大學實驗動物中心提供[合格證號：SYXK(滬)2012-0003)]，鼠齡6 ～ 8周，體質量160 ～ 200 g。采用隨機數字表法將大鼠分為實驗組和對照組，每組各15只。

2 肺動脈高壓模型建立 健康雄性SD大鼠適應性喂養1周，分籠喂養，每籠5只大鼠，自由飲水，進食普通飼料。野百合堿結晶(美國Sigma Chemical公司)用無水乙醇與0.9%氯化鈉注射液混合液(1∶4)配成1%溶液，實驗組大鼠按50 mg/kg，一次性頸背部皮下注射。對照組大鼠頸背部皮下注射0.9%氯化鈉注射液1 ml。

3 血流動力學檢測 給藥3周后行右心導管檢查。大鼠稱重后予30 ml/kg水合氯醛腹腔注射麻醉。將麻醉好的動物仰位固定于手術板上。手術區域頸部剪毛，消毒，于胸骨上窩向上沿正中切開約1 cm皮膚，逐步鈍性分離皮下組織和肌肉。參照袁平等[1]改良心導管測定大鼠肺血管阻力的方法，沿右鎖骨上5 mm處分離頸外靜脈，游離約1 cm，結扎血管遠心端，剪口，插入自制彎曲的PE-50導管，固定。導管末端彎曲向左下方向緩慢推進，1 ～2 cm到達頸外靜脈與腋靜脈交匯處，順時針旋轉導管進入上腔靜脈，繼續向前推進1 ～ 2 cm進入右心房，適當旋轉繼續推進1 cm，若感阻力明顯下降，多道生理儀顯示右心室波形后提示導管進入右心室。導管前端在右心室停留片刻，使其能流向肺動脈入口，然后緩慢推進0.5 ～ 1 cm，當顯示器呈現“M”與“N”交替的肺動脈波形時，提示導管已進入肺動脈，固定導管，記錄壓力曲線。

4 組織學觀察 大鼠右心導管測壓后放血處死大鼠，取出心臟，去左、右心房及相連的大血管，游離右心室(right ventricular，RV)、左心室(left ventricular，LV)與室間隔(interventricular septum，IVS)，0.9%氯化鈉注射液沖洗掉附在其上的血栓，濾紙吸去組織表面水分，稱重，計算右心室肥厚指數，即RV/(LV+IVS)。各部分組織在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，常規石蠟包埋，連續切片，備用于伊紅染色(Hematoxylin-Eosin staining，HE)和免疫組化。選取10個與呼吸性細支氣管及肺泡管伴行的直徑75 ～ 150 μm的肺小動脈，400倍光學顯微鏡下拍照，用Image J圖像分析軟件測量血管內徑(D1，內彈力膜間距)、血管外徑(D2，外彈力膜間距)、血管腔內面積(A1，內彈力膜內面積)和血管壁內面積(A2，外彈力膜內面積)，計算肺小動脈管壁厚度百分比(percentage of wall thickness，WT%)與管腔面積百分比(percentage of wall area，WA%)。WT%=(D2-D1)/D2×100%反映肺小動脈管壁的增殖程度，WA%=(A2-A1)/A2×100%反映肺小動脈管腔的狹窄程度。肺組織PCNA免疫組化染色切片用Image-Pro Plus軟件掃描作積分光密度(IA)值半定量分析，每只大鼠隨機觀察10個高倍視野取平均值。

5 統計學處理 統計分析以SPSS19.0軟件進行。數據經正態分布檢驗后，以-x±s表示，數據采用Oneway ANOVA檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 建模情況 實驗組大鼠于注射野百合堿后第2周末逐漸出現進食量和活動量減少、反應遲鈍、體質量下降、毛發干枯、呼吸頻率加快、喘息加重等癥狀，且癥狀進行性加重，在第18、20天時各死亡1只，死亡前表現為口唇部有出血點、呼吸急促、萎靡不振等癥狀。正常對照組大鼠生長良好，無異常變化及死亡。

2 血流動力學 給藥后第22天，兩組大鼠行右心導管檢查，其中實驗組大鼠13只，對照組大鼠15只。正常組大鼠12只成功完成了右心導管檢查，測量了右心室壓和肺動脈壓力；2只PE50導管無法進入右心室；1只PE50導管進入右心室后，反復嘗試無法進入肺動脈。實驗組大鼠11只成功測量右心室壓和肺動脈壓力，2只PE50導管無法進入右心室。右心導管檢查結果顯示，實驗組大鼠注射野百合堿后第3周末的右心室收縮壓、平均肺動脈壓均顯著高于正常對照組大鼠(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠血流動力學參數Tab. 1 Indexes of hemodynamics in rats

3 病理 對照組大鼠全身各組織均無異常改變，實驗組大鼠肺組織(尤其左肺中、下葉)明顯發暗，可見片狀淤血、瘀斑。肺組織HE染色顯示，對照組大鼠肺泡完整，肺間質無炎性細胞浸潤，肺小動脈血管壁光滑無增厚，管腔無狹窄，血管內皮細胞分布均勻，連續性完整；實驗組大鼠肺泡明顯破壞，肺間質增厚伴有中性粒細胞浸潤，肺小動脈血管壁明顯增厚，管腔狹窄，內皮細胞連續性不完整，中層平滑肌細胞增殖肥大、排列紊亂(圖1)。大鼠肺小動脈中膜厚度百分比和中膜面積百分比實驗組均明顯高于對照組(P＜0.01)；右心室肥厚指數[RV/(LV+IVS)]，實驗組亦顯著高于對照組(P＜0.01)。PCNA抗體免疫組化染色IA值實驗組較對照組有明顯增高(P＜0.01)。見圖2，表2。

表2 兩組大鼠肺小動脈與右心肥厚指數檢測結果Tab. 2 Results of pulmonary arterioles and right ventricular hypertrophy in rats

aP＜0.01, vs control

圖 1 大鼠肺血管HE染色(×200) A：實驗組； B：對照組Fig. 1 HE staining of pulmonary artery in rats (×200) A: experimental group; B: control group

圖 2 大鼠肺血管PCNA免疫組化(×200) A：實驗組； B：對照組Fig. 2 PCNA immunohistochemistry of pulmonary artery in rats (×200) A: experimental group; B: control group

討 論

肺動脈高壓動物模型的成功建立是肺動脈高壓相關性研究的前提和基礎，為其提供了可靠的實驗平臺。據文獻報道，建立肺動脈高壓大鼠模型一般有4種方法，即野百合堿誘導模型、低氧模型、高肺血流模型和野百合堿誘導聯合高肺血流模型，前兩種應用較多，后兩種使用較少[2-4]。野百合堿可引起肺血管內皮損傷、血管重構，進而導致肺血管阻力增加，肺動脈高壓形成，這與人肺動脈高壓發病的病理生理機制類似[5]。

野百合堿屬于雙稠吡咯啶生物堿，藥物本身無直接活性，進入機體后在肝內經P450單氧化酶轉化成具有活性的野百合堿吡咯[6]。它可選擇性地損傷肺動脈內皮，使內皮源性的一氧化氮的合成和分泌明顯減少，同時增加縮血管物質的釋放，如內皮素1、血小板源性生長因子等，從而引起肺動脈持續性收縮、血管腔狹窄或閉塞。此外，內皮細胞壞死脫落容易啟動內源性和外源性凝血途徑，導致血栓形成，最終誘導肺動脈高壓的發生[7-8]。Labinskyy等[9]研究發現，野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺動脈周圍有大量中性粒細胞浸潤，炎癥反應明顯。體外實驗顯示野百合堿對神經膠質細胞具有明顯的毒性作用，在肝內經細胞色素P450代謝產生具有生物活性的脫氫野百合堿，非競爭性抑制了呼吸鏈復合體Ⅰ，損害線粒體膜電位，消耗了細胞內三磷酸腺苷，干擾了各種途徑的糖代謝產生，從而抑制了肝能量代謝[10-12]。

在建立野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型中，為了提高建模的成功率，需要關注以下問題：1)野百合堿溶液配制的溶劑有兩種，一種是先用鹽酸充分溶解，再用氫氧化鈉滴定，使pH值達到7.4；另一種是采用1∶4的無水乙醇/0.9%氯化鈉注射液進行溶解，這兩種方法效果類似，不影響建模的成功率，但后一種方法操作更為簡單。2)野百合堿注射的部位，絕大多數文獻采用頸背部皮下注射，也有少部分文獻報道可以通過腹腔注射；腹腔注射野百合堿在肺動脈高壓自然發病過程中并不存在，這種方法復制的肺動脈高壓動物模型不能真實地反映肺動脈高壓病理生理狀態；腹腔內腹膜面積大、吸收快，野百合堿的毒性作用可使大鼠死亡率升高[13-14]。3)野百合堿注射的劑量，肺動脈高壓建模使用的野百合堿劑量可以為30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg或60 mg/kg，藥物使用劑量越大，肺血管破壞就越嚴重，肺小動脈增殖和重構越明顯，肺動脈壓力也就越高，同時大鼠的死亡率也隨之上升；但低劑量組造模時間稍長，需要4周以上，而高劑量組在第3周就顯示造模成功[15-16]。在本研究中，我們建模采用的是50 mg/kg野百合堿大鼠頸背部皮下注射，這樣既保證了大鼠肺動脈高壓的造模成功率，又降低了其死亡風險。4)野百合堿注射的頻率，野百合堿會引起肺血管內皮破壞、刺激中膜增殖、導致肺血管重構，這種作用比較劇烈，1次注射藥物就可成功建立肺動脈高壓的模型。5)大鼠飼養注意通風、清潔，適宜的溫度和濕度，定期喂食、水可以有效提高大鼠生存率。本實驗中，野百合堿注射3周后右心導管檢查顯示，與正常對照組相比，實驗組大鼠右心室收縮壓、肺動脈壓均明顯升高，平均肺動脈壓均超過25 mmHg，達到了中度以上肺動脈高壓的標準。實驗組大鼠HE染色的病理切片顯示，肺血管增殖、重構，肺間質增生伴大量炎細胞浸潤，肺小動脈內皮細胞連續性不完整，中層平滑肌細胞增殖肥大、排列紊亂，管壁增厚管腔狹窄；肺血管PCNA免疫組化顯示，肺血管中膜明顯增殖。而且，實驗組大鼠出現肺小動脈管腔內明顯淤血，氣管有少許血液滲出等右心功能衰竭征象，這些都提示肺動脈高壓大鼠模型成功建立。

本研究證實了，野百合堿注射誘導大鼠肺動脈高壓是一種操作簡單、有效、可靠的理想動物模型。在實驗過程中，對于野百合堿的溶質選擇、配制濃度、注射部位以及注射頻率等條件的準確把握，是提高和確保建模成功率的關鍵。

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Monocrotaline injection in establishing rat model of pulmonary hypertension

LI Songhua1, SHI Renhua1, ZHU Qin2, SHI Chengyong1, DU He1, ZHAO Xianxian1, CHEN Shaoping1, QIN Yongwen11Department of Cardiovasology, Changhai Hospital;2Retired Cadres Sanatorium in Xiangyin Road Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

QIN Yongwen. Email: qyw2009@163.com

Objective To investigate the method and key points of monocrotaline injection in establishing pulmonary hypertension model of rats. Methods Thirty Sprague dawley (SD) male rats of SPF grade were randomly divided into two groups: experiment group (n=15) and control group (n=15). The experimental rats received subcutaneous injection of monocrotaline accounting for 50 mg/kg, and rats in control group received subcutaneous injection of 0.9% sodium chloride accounting for 1 ml. Three weeks later, the rats underwent right heart catheterization, pathology and immunohistochemistry. Results Rats in experimental group showed progressive right heart failure with 2 rats died. The mean pulmonary artery pressure and right ventricular systolic pressure in experimental rats were significantly higher than control group [(40.05±1.78) mmHg vs (18.63±1.80) mmHg (1 mmHg=0.133 kPa), (62.99±2.03) mmHg vs (28.04±2.26) mmHg, P＜0.05]. HE staining showed rats in the experimental group with pulmonary vascular membrane hyperplasia and stenosis, and WT%, WA%, RV/(LV + IVS) in rats of experimental group were signif i cantly higher than control group [(0.292±0.064) vs (0.106±0.026), (0.0495±0.092) vs (0.200±0.045), (0.473±0.041) vs (0.295±0.035), P＜0.05]. IA value of pulmonary vascular PCNA immunohistochemistry in experimental group was significantly higher than control group [(39.5±8.7) vs (18.5±5.3), P＜0.05]. Conclusion Monocrotaline injection in establishing rat model of pulmonary hypertension is a simple, effective and reliable method, and the modeling success rate can be improved with a few key points.

pulmonary hypertension; rats; monocrotaline; animal model

R 692

A

2095-5227(2015)02-0171-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.020

時間：2014-10-20 16:15

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141020.1615.002.html

2014-07-29

上海市科學技術委員會科研計劃項目(13ZR1409000)；上海市衛生局局級科研項目(2012461)；長海醫院“1255”學科建設計劃資助項目(CH125531702)

Supported by Project of the Science and Technology Committee of Shanghai (13ZR1409000); Shanghai Health Bureau Scientific Research Found Project (2012461)

李松華，男，博士，主治醫師。研究方向：肺血管疾病。Email: lisonghua2000@163.com；共同第一作者：石仁華，學士，醫師。研究方向：疾病預防與控制。Email: xiaohua0920@163.com

秦永文，男，主任醫師，主任，博士生導師。Email: qy w2009@163.com