胰腺癌血清學標記物在胰腺癌初期診斷中的研究進展

曾 強，鞏 燕

解放軍總醫院 健康管理研究院，北京 100853

胰腺癌血清學標記物在胰腺癌初期診斷中的研究進展

曾 強，鞏 燕

解放軍總醫院 健康管理研究院，北京 100853

胰腺癌是目前最難診斷和治療的惡性腫瘤之一，研究開發方便實用的血清標記物篩查早期胰腺癌有重要的臨床意義。目前，胰腺癌血清學標記物的研究主要包括胰腺癌特異表達的分子、基因突變、異常甲基化DNA、microRNA和循環腫瘤細胞。聯合多種血清學標記物有助于其早期診斷，未來的研究應側重于篩選胰腺癌高危人群，形成高度敏感性和特異性的標記物，提高胰腺癌早期診斷水平。

胰腺癌；血清標記物；早期診斷

胰腺癌是目前最難診斷和治療的惡性腫瘤之一，80%以上的胰腺癌確診時已處于晚期，其中位生存期在8個月左右[1-4]。開發方便實用的血清標記物篩查早期胰腺癌有重要的臨床意義[5]。目前，胰腺癌血清學標記物的研究包括胰腺癌特異表達的蛋白質分子、基因突變、異常甲基化DNA、microRNA和循環腫瘤細胞等，本文就其研究進展做一綜述[6-9]。

1 胰腺癌特異的蛋白質分子或蛋白譜

1.1 抗黏蛋白1抗體(PAM4-based MUC1) PAM4是一種由RIP1小鼠胰腺癌移植瘤中獲得的抗黏蛋白1(mucin-1，MUC-1)的單克隆抗體，MUC-1是一種高度糖基化的黏蛋白，可以促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，進而影響胰腺癌患者的生存時間[10]。Gold等[11-13]采用EILSA法測定胰腺癌、慢性胰腺炎及健康人群血清MUC-1表達水平，發現PAM4診斷胰腺癌的敏感度為81%，特異度為95%，對1期和2期的敏感度分別為62%和86%，并且診斷特異性優于糖類抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)(85% vs 68%)。通過免疫組化方法檢測非侵襲性胰腺腫瘤，如胰管上皮內瘤變及導管內乳頭狀黏液瘤的敏感性為87.3%，特異性為92.1%，提示該抗體所針對的抗原通常在胰腺癌發生的早期表達，對其進行檢測有助于胰腺癌的早期發現和診斷。

1.2 高流動蛋白1(extracellular high mobility group box-1，HMGB1) HMGB1被認為是一種核蛋白，其細胞外形式類似細胞因子發揮作用，參與如炎癥、細胞遷移、組織再生等許多重要的病理過程，有助于腫瘤的生長和侵襲[14-15]。比較正常、慢性胰腺炎和胰腺癌患者血清HMGB1水平，發現它與胰腺癌及分期有關，ROC曲線和Logistic回歸分析證實HMGB1作為預測胰腺癌單一或多重生物標記物之一，其靈敏度/特異性優于CA 19-9或癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，Kaplan-Meier生存分析顯示高水平HMGB1的胰腺癌患者(＞30 ng/ml，中位生存期192 d)較低水平HMGB1患者(≤30 ng/ml，中位生存期514 d)預后差，Cox比例風險模型顯示，高血清HMGB1組較低血清HMGB1組患胰腺癌相對危險比為3.077。與CA19-9和CEA進行比較，HMGB1是胰腺癌診斷和預后評價更為理想的標記物[16]。

1.3 胰島素樣生長因子結合蛋白2(insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2)和間皮素(mesotelin，MSLN) 采用EILSA法在84例胰腺癌患者、40例慢性胰腺炎和84名健康對照中，測定血清IGFBP2和MSLN水平，發現血清IGFPB2和MSLN診斷胰腺癌的靈敏度分別為22%(P=0.032)和17%(P=0.002)，較CA19-9低。然而，IGFBP2和(或) MSLN兩者聯合確診了CA19-9漏診的28例胰腺癌中的18例，這提示，血清IGFBP2和MSLN單獨診斷胰腺癌敏感性低，但在聯合診斷時具參考價值[17]。

1.4 蛋白譜 基于質譜的血清肽譜是一種有前途的發現新的疾病相關蛋白質的工具，Zapico-Muniz等[18]通過基質輔助激光解吸/電離-飛行時間質譜比較健康對照、慢性胰腺炎和胰腺癌患者的血清肽譜，忽略性別和年齡的影響，聯合2種血清肽譜和CA19-9診斷胰腺癌靈敏度為89.9%，特異度為92.7%，聯合3種血清肽譜區分胰腺癌與健康對照及慢性胰腺炎，其敏感度98.2%，特異度97.1%。Ehmann等[19]通過陰離子交換色譜法 確定載脂蛋白A-Ⅱ，轉甲狀腺素蛋白和載脂蛋白AI與胰腺癌相關，與健康對照組相比，它們在胰腺癌血清中水平均下降至少2倍。同樣經此種方法確定血小板第4因子與胰腺癌有關[20]。采用2-維-凝膠電泳比較胰腺癌及對照血清標本，進行差異蛋白質分析顯示，甘露糖結合凝集素2和肌球蛋白輕鏈激酶2蛋白表達上調，免疫印跡證實它們在胰腺癌組織表達升高[21]。聯合蛋白質芯片技術及2維凝膠電泳發現熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)在胰腺癌與健康對照組表達差異，通過ELISA法檢測35例胰腺癌患者和37名健康個體血清樣本，HSP27診斷胰腺癌靈敏度為100%。特異度為84%[22]。以上研究提示，血清差異蛋白有望作為胰腺癌早期診斷的潛在標記物。

2 K-ras基因突變

已知胰腺癌K-ras基因突變的發生率很高。Chen等[23]研究發現在30例(共91例)患者血漿中K-ras12號密碼子突變率為33%(30/91)，其中17個突變為c.35G＞A(p.G12D)，11個突變為c.35G＞T(p.G12V)，只有2個為c.34G＞C(p. G12R)。K-ras12號密碼子突變與腫瘤TNM分期(P=0.033)和肝轉移(P=0.014)有關。K-ras突變患者的中位生存時間少于野生型K-ras基因患者(3.9個月vs 10.2個月，P＜0.001)，另一項研究在30例胰腺癌患者的血漿和腫瘤組織，40例慢性胰腺炎患者血漿中，采用突變等位基因特異性擴增法和直接測序法檢測12號密碼子突變，同時檢測腫瘤標記物如CA19-9、CEA、CA50、CA242。在70%腫瘤組織樣品中檢測到K-ras突變，但在血漿DNA樣品中未檢測到K-ras突變，60%具有K-ras突變的患者CA199、CEA、CA50和CA242升高，但其靈敏度(20.00% ～ 56.67%)和特異度均偏低(56.67% ～ 77.5%)。這些數據表明，在血清中的K-ras基因突變用于篩選胰腺癌患者以及胰腺腫瘤高危進展人群的方法尚需進一步驗證[24]。

3 抑癌基因的甲基化

除基因突變外，抑癌基因的甲基化在腫瘤包括胰腺癌在內其發生發展中發揮重要作用，研究它有望找到胰腺癌早期的標記物。Yi等[25]經全基因轉錄組在胰腺癌細胞系鑒定出新的發生DNA甲基化的腫瘤特異性基因后，使用納米粒子處理的甲基化磁珠技術分析患者血清中BNC1和ADAMTS1基因啟動子區域DNA甲基化，結果提示143例胰腺癌中BNC1和ADAMTS1基因甲基化率分別為92%和68%，在Ⅲ期胰腺上皮內瘤變兩者甲基化率接近100%，在Ⅰ期浸潤性癌其甲基化率為97%，42例胰腺癌患者血清中，BNC1敏感度為79%，ADAMTS1敏感度為48%，BNC1特異度89%，ADAMTS1特異度92%。聯合兩種標記物的靈敏度提高為81%，特異度僅為85%。Park等[26]研究發現，胰腺癌患者NPTX2甲基化率與慢性胰腺炎相比顯著升高(P=0.016)，其敏感度和特異度分別為80%和76%，NPTX2基因甲基化水平隨腫瘤進展顯著增高。

除單個基因甲基化的研究外，有報道采用甲基化譜進行胰腺癌的早期診斷。Melnikov等[27]納入30例胰腺癌患者，根據性別和年齡匹配原則入選30例健康對照組，比較兩者血漿甲基化譜，確定了包括CCND2、SOCS1、THBS1、PLAU、VHL在內的基因組，聯合診斷胰腺癌敏感度為76%，特異度為59%，可應用于胰腺癌早期診斷。

4 MicroRNA

MicroRNA是小的非編碼轉錄體，參與包括腫瘤發生在內的多種細胞生理病理過程。最近的研究表明，血漿/血清中穩定地檢測到微RNA(miRNA)。與健康對照組相比，miR-200家族的兩個成員中miR-200a和miR-200b在胰腺癌和慢性胰腺炎患者的血清中均顯著升高(P＜0.000 1)，受試者工作曲線下面積分別為0.861和0.85[8]。由于胰腺癌顯示極端低氧特征，Ho等[28]推測miR-210(在低氧下誘導，與腫瘤不良反應有關)可作為胰腺癌篩選或監控的診斷性標記物，從血漿直接提取miRNA并逆轉錄為cDNA，celmiR-54作為正常對照，采用qRT-PCR檢測miR-210和cel-miR-54，與正常對照相比，胰腺癌患者miR-210表達超過4倍以上(P＜0.001)。有研究報道，胰腺癌患者血漿miR-221濃度顯著高于胰腺良性腫瘤(P=0.016)和健康對照組(P＜0.001)；在術后樣品中顯著減少(P=0.018)，與遠處轉移(P=0.041)和非切除狀態有關(P=0.021)[29]。

以上研究提示，胰腺癌相關血漿miR的測定可作為腫瘤檢測、監測腫瘤動力學和評價預后的生物標記物，并可能有助于胰腺癌的臨床治療決策。

5 循環腫瘤細胞

胰腺癌常常經血液轉移至遠處器官，如肝、肺和骨骼系統。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是具有進入循環系統能力的腫瘤細胞，這些細胞群在腫瘤遠處轉移中發揮舉足輕重的作用。臨床研究顯示，血液中CTCs的存在與乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌的進展有關，并用來預測轉移性腫瘤的生存期[30]。Kurihara等[31]檢測胰腺癌患者的CTCs水平，預測胰腺癌的生存期，26例胰腺癌患者中11例CTC陽性，15例CTC陰性(Ⅱ期1例，Ⅲ期1例，Ⅳa期7例，Ⅳb期6例)，CTC陽性和陰性患者的中位生存時間(median survival time，MSTS)分別為110.5 d和375.8 d (P＜0.001)。對于Ⅳb患者，CTC陽性和陰性患者的MSTS分別為52.5 d和308.3 d (P＜0.01)。這項研究表明檢測外周血的CTCs可能有助于胰腺癌患者的預后判斷。

Han等[32]通過BM7(靶向黏蛋白1，mucin1)和VU1D9抗體(靶向上皮細胞黏附分子，EpCAM)的免疫磁性富集，評價34例全身治療前胰腺癌患者和40例健康對照者CTCs的水平，通過實時定量RT-PCR分析KRT19、MUC1、EPCAM、CEACAM5和BIRC5基因的表達，結果顯示47.1%胰腺癌CTCs陽性患者，與CTC陰性患者比較，具有較短的中位無進展生存期(progression free survival，PFS)，CTCs陽性患者的中位PFS時間66.0 d，CTC陰性患者的中位PFS 138.0 d (P=0.01)。

一項國際多中心隨機研究納入79例患者，化療開始前及治療2個月后進行CTC篩選，5%患者檢測到一個或多個CTCs，治療2個月后，9%的患者檢測到CTCs(總檢出率為11%)。CTC陽性與較差的腫瘤分化程度有關(P=0.04)，CTC陽性總生存期更短(RR=2.5，P=0.01)。CTC檢測可作為一種有前途的判斷胰腺癌患者預后的工具[33]。一篇薈萃分析結果也顯示，CTC陽性與較差無進展生存期顯著相關(HR=1.89，95% CI=1.25 ～ 4.00，P＜0.001)，與CTC陰性患者相比，CTC陽性胰腺癌患者表現出較差的整體存活率，(HR=1.23，95% CI=0.88 ～ 2.08，P＜0.001)。按種族亞組分析表明，亞洲人和白種人群中CTC陽性患者具有更差的生存期(均P＜0.05)。以上研究提示，在外周血中檢測CTC可能是一種很有前途的用于胰腺癌檢測和預后的生物標記物[34]。

6 結語

胰腺癌的發生涉及多個基因、信號途徑、轉錄因子、miRNA等相互作用，聯合多種血清學標志物有助于其早期診斷；Ginesta等[35]在61例細針抽吸胰腺腫塊(43胰腺癌和18例慢性胰腺炎)中，進行HRH2、EN1、SPARC、CDH13和APC基因的甲基化狀態和K-ras基因突變分析，結果提示基因甲基化對胰腺癌敏感度73%，特異度100%；K-ras突變敏感度77%，特異度100%；聯合分析其敏感度升高到84%，特異度100%。已有研究報道采用HMGB1與CA19-9、PAM4和CA 19-9、miR-16和CA19-9聯合后提高了胰腺癌檢測的靈敏性和特異性[36-38]。新型血清標記物的研究及標記物的聯合使用提高了胰腺癌診斷診斷和預后評估的敏感性和特異性，已在多個臨床試驗中證實，由于為較小的樣本量，研究結果可能仍處初步階段，對于胰腺癌早期診斷的臨床試驗仍需進一步完善。

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Serological markers of pancreatic cancer in early diagnosis of pancreatic cancer

ZENG Qiang, GONG Yan
Health Management and Research Institute, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Pancreatic cancer is a kind of malignant tumor which is very diff i cult to diagnose and cure. Researches in developing convenient serological markers in screening the early curable stage of pancreatic cancer have important clinical signif i cance. At present, the study of serological marker of pancreatic cancer includes the molecular of pancreatic cancer-specif i c expression, gene mutations, abnormal methylation of gene DNA, microRNA and circulating tumor cells. Combinations of different serological markers can contribute to the early diagnosis of pancreatic cancer, and further researches should focus on the screening of high-risk groups with pancreatic cancer and the development of highly sensitive and specif i c markers, in order to improve the diagnostic level of pancreatic cancer.

pancreatic cancer; serum markers; early diagnosis

R 730.3

A

2095-5227(2015)02-0184-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.025

時間：2014-10-11 10:23

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141011.1023.002.html

2014-08-07

全軍十一五計劃保健專項(10BJZ18)

Supported by the 11th Five Years Programs for Health Care Plan of Chinese PLA (10BJZ18)

曾強，男，博士，研究員，主任，教授。研究方向：健康管理。Email: zq301@126.com

The fi rst author: ZENG Qiang. Email: zq301@126.com