孕烷X受體應(yīng)答元件螢光素酶報告基因的構(gòu)建及活性檢測

馮 帆，張 帆，司 文,3，高旭東，王春平，楊予濤，楊俊蘭，楊永平，史國兵

1沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，遼寧沈陽 110016；2解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；3南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300192；4解放軍第302醫(yī)院 肝臟腫瘤診療與研究中心，北京 100039；5首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100071

孕烷X受體應(yīng)答元件螢光素酶報告基因的構(gòu)建及活性檢測

馮 帆1，張 帆2，司 文2,3，高旭東4，王春平4，楊予濤5，楊俊蘭2，楊永平4，史國兵1

1沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，遼寧沈陽 110016；2解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；3南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300192；4解放軍第302醫(yī)院 肝臟腫瘤診療與研究中心，北京 100039；5首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100071

目的建立孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)應(yīng)答元件螢光素酶報告基因，并檢測其活性。方法利用化學(xué)合成方法得到五聚體PXR應(yīng)答元件(everted repeat elelment-6，ER-6元件)5和(direct repeat element-3，DR-3)5序列；將五聚體PXR應(yīng)答元件序列(ER6或DR3)克隆至pGL3-Promoter載體上；利用螢光素酶報告基因系統(tǒng)檢測PXR應(yīng)答元件報告基因的活性。結(jié)果PXR應(yīng)答元件螢光素酶報告基因具有明確的活性。PXR激動劑茴香霉素能夠劑量依賴地誘導(dǎo)ER6-Luc (R2=0.95；P=0.002 2)和DR3-Luc (R2=0.96；P=0.000 91)報告基因的活性，其EC50值分別為(0.11±0.04)μmol/L和(0.13±0.06) μmol/L；PXR拮抗劑酮康唑能夠劑量依賴地降低茴香霉素誘導(dǎo)的ER6-Luc (R2=0.97；P=0.000 85)和DR3-Luc (R2=0.98；P=0.000 11)的活性，IC50值分別為(0.71±0.11)μmol/L和(1.73±0.15)μmol/L。結(jié)論成功構(gòu)建了PXR應(yīng)答元件報告基因，建立了PXR轉(zhuǎn)錄活性的檢測方法。

孕烷X受體；孕烷X受體應(yīng)答元件；螢光素酶報告基因；轉(zhuǎn)錄活性；

孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)是一種重要的核受體，最初僅被確定為類固醇激素受體[1-6]。PXR在消化系統(tǒng)腫瘤中分布廣泛，其結(jié)構(gòu)由N-末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，N-TD)、保守的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain，DBD)、C-末端的配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain，LBD)組成。PXR的LBD結(jié)構(gòu)高度可變，這保證了其廣譜的配體結(jié)合/應(yīng)答范圍[6]。PXR分布于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)與配體結(jié)合后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，進(jìn)而啟動/介導(dǎo)其下游基因的轉(zhuǎn)錄[6]。PXR的DBD包含兩個鋅指結(jié)構(gòu)，能夠和維甲酸X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異二聚體，與其下游基因(CYP 3A4等)的啟動子區(qū)所包含的PXR應(yīng)答元件結(jié)合[6]。PXR結(jié)合元件分為：DRs、ERs以及IRs等不同回文序列[6]。PXR的下游基因種類多作用廣，不同下游基因啟動子可能具有不同的PXR應(yīng)答元件模式[6]。PXR的活性受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)輔因子(SRCs、NCoRs或SMRT)，以及不同配體的調(diào)控[7]。隨著研究的進(jìn)展，多種內(nèi)/外源藥物/化合物都被確定是PXR的配體/激動劑[2]。這些藥物能夠活化PXR，誘導(dǎo)代謝酶(CYP 450等)及藥物轉(zhuǎn)運體(MDR等)的表達(dá)，對這些藥物或者其他藥物進(jìn)行代謝和清除，最終影響治療效果[3]。由于包括紫杉醇和絲裂霉素在內(nèi)的多種化療藥物能夠作為PXR的配體將其活化，因此以PXR為調(diào)控樞紐的藥物代謝系統(tǒng)可能是腫瘤多藥耐藥，以及化療藥耐受的新分子機制[3]。PXR的活性受到多重因素的調(diào)控，利用螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)能夠快速檢測PXR的活性。本研究利用化學(xué)合成方法，獲得5聚體的PXR結(jié)合元件(direct repeat element-3，DR-3)5和(everted repeat elelment-6，ER-6元件)5序列，將其克隆到pGL-3Promoter載體中，利用PXR的激動劑茴香霉素及拮抗劑酮康唑檢測PXR應(yīng)答元件報告基因ER6-Luc和DR3-Luc的活性[4-5，8-10]。

材料和方法

1 實驗材料 質(zhì)粒pGL3-Prpmopter、β-gal載體和大腸埃希菌DH5α由首都醫(yī)科大學(xué)楊予濤博士惠賜；HepG2細(xì)胞由本實驗室保存；退火用上下游引物(寡核苷酸)(圖1)由SBS公司合成(為2 OD的粉末)，溶于200 μl 10 mmol/L pH=8.0 Tris緩沖液中；KpnⅠ和XhoⅠ限定性內(nèi)切酶，以及T4 DNA連接酶等購自New England Biolab公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒以及Luciferase報告基因試劑盒等購自Promega公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根公司(Qiangen)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin AMINE2000購自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)實驗室用DMEM培養(yǎng)基、和小牛血清購自Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板等購自Corning公司；工具藥物：茴香霉素和酮康唑購自美國Sigma公司，由質(zhì)譜確證其結(jié)構(gòu)正確，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測其純度＞98%，使用DMSO配制成3 mmol/L的母液，4℃保存。

2 PXR應(yīng)答元件序列的克隆 在PXR下游基因CYP 3A4啟動子區(qū)序列中，根據(jù)其啟動子區(qū)域中包含的PXR結(jié)合位點ER6和DR3(-7836/-7208區(qū)域)設(shè)計五聚體序列，添加以XhoⅠ和KpnⅠ半酶切位點(圖1)，按照如下體系(表 1)和條件(表2)進(jìn)行退火，按照廠商說明書，使用Promega公司DNA回收試劑盒回收所得ER6和DR3序列。

圖 1 退火實驗獲得雙鏈ER6和DR3元件序列所用的引物 A: DR3元件序列的引物； B ER6元件序列的引物Fig. 1 Premiers used in annealing process for double strands DR3 or ER6 sequences A: Premiers of DR3 element sequences; B: Premiers of ER6 element sequences

表 1 獲得雙鏈ER6和DR3序列的退火實驗體系Tab. 1 System of annealing process to obtain the doublestrands DR3 or ER6 sequences

表2 獲得雙鏈ER6和DR3序列的退火實驗方法Tab. 2 Methods of annealing process to obtain the double strands DR3 or ER6 sequences

3 DR3-Luc和ER6-Luc報告基因載體的構(gòu)建 將pGL3-Prpmopter載體使用XhoⅠ和KpnⅠ，37℃酶切4 ～ 6 h(表3)，瓊脂糖凝膠電泳回收。使用T4連接酶(表4)連接PXR應(yīng)答元件序列和pGL3-Prpmopter載體，16℃連接2 ～ 4 h，4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪板、挑菌、擴增并提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定。將PCR鑒定無誤的克隆進(jìn)行測序(華大公司)鑒定。

4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 使用添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至指數(shù)增長期，用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，將HepG2細(xì)胞種于24孔板(80% ～ 90%密度)，接種24 h后，將DR3-Luc和ER6-Luc，以及內(nèi)參β-gal質(zhì)粒與不含血清的80 μl DMEM培養(yǎng)基混合；再將80 μl DMEM培養(yǎng)基與2.5 μl Lipoffect AMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑混合；最后將轉(zhuǎn)染試劑和DNA混合，室溫靜置15 min，加入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒的細(xì)胞，進(jìn)行藥物處理。使用1 μmol/L、0.3 μmol/L、0.1 μmol/L、0.03 μmol/L、0.01 μmol/L、0.003 μmol/L、0.001 μmol/L的系列濃度梯度的Anisomycin處理細(xì)胞，或0.3μmol/L Anisomycin預(yù)處理細(xì)胞3 ～ 5 h后，再加入10 μmol/L、3 μmol/L、1 μmol/L、0.3μmol/L、0.1 μmol/L、0.03 μmol/L、0.01 μmol/L的系列濃度梯度的Ketoconazole。

5 DR3-Luc和ER6-Luc報告基因活性的測定 基本按照王博等[11]的方法，以及Promega公司提供的Luciferase試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞1次，加入160 μl Promega公司提供的裂解緩沖液，放置在水平搖床上充分反應(yīng)15 min，再將細(xì)胞刮下，移入1.5 ml EP管中，漩渦振蕩15 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，取上清液測定熒光素酶活性。在此基礎(chǔ)上，用ONPG檢測β-gal的活性，取前述所得上清液，約10 μl加入到450 μl含有2.7 ml/L β-巰基乙醇的Z-Buffer中，再加入100μl的0.4%鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)溶液，37℃孵育，當(dāng)出現(xiàn)淺黃色后，加入250 μl 1 mol/L的Na2CO3溶液終止，測定OD值。利用Luciferase和β-gal計算報告基因活性，在此基礎(chǔ)上計算Luciferase的相對活性和抑制率，計算公式[12]為：

相對活性(%)=(藥物處理組報告基因活性-溶劑對照組報告基因活性)/(藥物最大作用組報告基因活性-溶劑對照組報告基因活性)×100%。

藥物作用抑制率(%)=(激動劑處理組報告基因活性-藥物處理組報告基因活性)/(激動劑處理組報告基因活性-溶劑對照組報告基因活性)×100%。

利用Origin 8.5軟件在此基礎(chǔ)上分別計算EC50和IC50值。

6 統(tǒng)計學(xué)分析方法 實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以-x±s表示。使用統(tǒng)計和繪圖軟件Origin 8.5中的Sigmoidal Fit模塊進(jìn)行回歸分析，擬合藥物作用的量效曲線并計算相應(yīng)EC50值和IC50值；使用Polymoidal Fit模塊計算藥物作用曲線的R2值和P值。

表3 限定性內(nèi)切酶酶切載體的實驗體系Tab. 3 System of enzyme-digestion experiment for vector

表4 T4連接酶連接實驗工作體系Tab. 4 System of T4 ligase experiment to obtain luciferase plasmids

結(jié) 果

1 PXR應(yīng)答元件報告基因表達(dá)載體的PCR鑒定

將重組所得DR3-Luc和ER6-Luc報告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5，挑取菌落后進(jìn)行菌落PCR鑒定，與空載體相比，插入DR3(圖2A)及ER6(圖2B)片段后，能夠得到PCR產(chǎn)物，而空載體則沒有相應(yīng)，結(jié)果均與預(yù)期相一致。

2 PXR應(yīng)答元件報告基因表達(dá)載體的測序鑒定將前述所得PCR鑒定正確的ER6-Luc和DR3-Luc載體的陽性克隆進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明所得序列與目的序列相一致，無突變發(fā)生(圖3)。

3 DR3-Luc和ER6-Luc報告基因的活性鑒定

PXR的激動劑茴香霉素能夠劑量依賴地升高ER6-Luc(R2=0.93；P=0.004 5)和DR3-Luc(R2=0.94；P=0.011)的活性(表5)。使用PXR的拮抗劑酮康唑(表5)，發(fā)現(xiàn)酮康唑能夠劑量依賴地降低茴香霉素誘導(dǎo)的ER6-Luc(R2=0.97；P=0.000 85)和DR3-Luc(R2=0.98；P=0.000 11)的活性。這表明，我們成功構(gòu)建了具有活性的PXR應(yīng)答元件螢光素酶報告基因表達(dá)載體。

圖 2 重組PXR 應(yīng)答元件報告基因的PCR鑒定 A: DR3-Luc 報告基因; B: ER6-Luc報告基因Fig. 2 Identif i cation of PXR response element luciferase reporters via PCR assays A: DR3-Luc reporter; B: ER6-Luc reporter

討 論

作為重要的核受體，PXR不僅在消化系統(tǒng)腫瘤中分布廣泛，在乳腺癌和肺癌細(xì)胞中也有表達(dá)[13-15]。PXR在其應(yīng)答基因啟動子區(qū)的結(jié)合元件多樣，可分為：DRs、ERs以及IRs等不同回文序列[6]。本研究選取PXR最為代表性的下游基因CYP 3A4啟動子區(qū)-7836/-7208區(qū)域中的ER6和DR3結(jié)合元件，設(shè)計并化學(xué)合成其五聚體序列，克隆到pGLPromoter載體上。利用PXR的激動劑和拮抗劑處理HepG2細(xì)胞進(jìn)行檢測，PXR的激動劑茴香霉素能夠劑量依賴地誘導(dǎo)ER6-Luc和DR3-Luc報告基因的活性；而PXR的拮抗劑酮康唑則能夠劑量依賴地抑制茴香霉素誘導(dǎo)的ER6-Luc和DR3-Luc報告基因的活性，這表明本研究成功構(gòu)建了PXR應(yīng)答元件報告基因表達(dá)載體，在此基礎(chǔ)上建立了PXR活性的檢測方法/模型。另一方面，PXR下游基因種類多作用廣，不同下游基因啟動子可能具有不同的PXR應(yīng)答元件模式，因此在進(jìn)一步研究中建立包括IR-Luc在內(nèi)的其他PXR結(jié)合元件具有重要意義[6]。

PXR的活性不僅受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)輔因子(SRCs、NCoRs或SMRT)，以及不同配體的調(diào)控，與其他旁路核受體的相互作用也具有重要意義[7]。PXR能夠和維甲酸X受體相互作用，其活性也與肝X受體(liver X receptor，LXR)、組成型雄甾烷受體(constitutive androstane receptor，CAR)以及維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)等存在廣泛相互作用，CYP 3A4的啟動子-2500區(qū)域就含有多個VDR結(jié)合位點，因此在進(jìn)一步研究中克隆CARPXR，以及VDR-PXR共有應(yīng)答基因啟動子區(qū)的VDR/CAR應(yīng)答元件亦具有重要意義[16-21]。

另一方面，肝癌具有天然的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)特性，這導(dǎo)致HCC患者對廣譜細(xì)胞毒性化療藥都極不敏感，同時對分子靶向藥物的臨床應(yīng)答也不確定[22-23]。由于肝是人體代謝的中心，肝癌細(xì)胞對化療藥等外源藥物代謝作用非常旺盛，因而以PXR為樞紐的藥物代謝和清除系統(tǒng)可能是肝癌等MDR的新的分子機制。除肝癌外，PXR也能夠在肺癌細(xì)胞中通過誘導(dǎo)MDR-1等的表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞中通過誘導(dǎo)乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)等的表達(dá)影響化療藥的活性[24-25]。另一方面，包括紫杉醇、絲裂霉素和喜樹堿在內(nèi)的多重細(xì)胞毒性化療藥物都能夠作為PXR的配體，誘導(dǎo)其下游基因的表達(dá)[1]。此外，Harmsen等[26]亦報道，包括厄洛替尼、吉非替尼、尼洛替尼、索拉菲尼、凡德他尼等分子靶向藥物(小分子蛋白激酶抑制劑)也能夠作為PXR的潛在配體誘導(dǎo)PXR的活性，誘導(dǎo)MDR相關(guān)基因的表達(dá)。上述藥物廣泛用于肝癌、肺癌或乳腺癌的化療，因此化療藥物對PXR活性的誘導(dǎo)作用可能是腫瘤化療過程中逐漸出現(xiàn)的藥物耐受的新分子機制。

圖 3 重組PXR 應(yīng)答元件報告基因的測序鑒定 A: DR3-Luc 報告基因; B: ER6-Luc報告基因Fig. 3 Identif i cation of PXR response element luciferase reporters via DNA sequencing A: DR3-Luc reporter; B: ER6-Luc reporter

本研究成功建立PXR結(jié)合/應(yīng)答元件DR3和ER6的螢光素酶報告基因，建立了PXR活性的檢測方法。利用DR3和ER6的螢光素酶報告基因能夠快速檢測PXR的活性，篩查具有對PXR激動劑樣活性的藥物，檢測臨床藥物的代謝特征(PXR/ CYP 3A4誘導(dǎo)實驗)。此外，酮康唑具有較為明確的PXR拮抗活性，也有報道指出二甲雙胍也能夠下調(diào)PXR介導(dǎo)的CYP 3A4的表達(dá)[2]。因此，本研究建立的實驗方法和技術(shù)體系也為進(jìn)一步研發(fā)PXR拮抗劑(有可能具有逆轉(zhuǎn)MDR以及化療藥物增敏作用)奠定了堅實基礎(chǔ)。

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Construction of pregnane X receptor response elements (ER6 and DR3) luciferase reporter and its transcription activity

FENG Fan1, ZHANG Fan2, SI Wen2,3, GAO Xudong4, WANG Chunping4, YANG Yutao5, YANG Junlan2, YANG Yongping4, SHI Guobing11Department of Pharmacy, The General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;2Department of Medical Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;3Medical College, Nankai University, Tianjin 300192, China;4Center for Liver Cancer, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China;5Institute of Disease Control and Prevention, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

s: YANG Yongping. Email: yongpingyang@hotmail.com; SHI Guobing. Email: guobingsh@163.com

Objective To construct the PXR response element luciferase reporter. Methods The pentamer-sequences of (Everted repeat elelment-6, ER-6 element)5and (Direct repeat element-3, DR-3 element)5were gained from chemical synthesis method. The pentamer-sequences of PXR response elements (ER-6 or DR-3) were cloned into pGL3-Promoter vectors. The transcriptional activity of PXR was measured by luciferase assay. Results The PXR response elements luciferase reporter was successfully constructed. The Anisomycin, which was the agonist of PXR, could induce the activity of ER6-Luc (R2=0.95; P=0.002 2) and DR3-Luc (R2=0.96; P=0.000 91) reporters in a dose dependent manner with the EC50value of (0.11±0.04)μmol/L and (0.13±0.06)μmol/L, respectively. The Ketoconazole, which was the antagonist of PXR, could inhibit the activity of ER6-Luc (R2=0.97; P=0.000 85) and DR3-Luc (R2=0.98; P=0.000 11) reporters induced by Anisomycin in a dose dependent manner with the EC50value of (0.71±0.11)μmol/L and (1.73±0.15)μmol/L, respectively. Conclusion The PXR response elements luciferase reporter is successfully constructed and the way to detect the transcriptional activity of PXR is established.

pregnane X receptor; pregnane X receptor response elements; luciferase reporter gene; transcriptional activity

R 73-3

A

2095-5227(2015)02-0166-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.019

時間：2014-09-05 10:12

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140905.1012.002.html

2014-08-08

國家科技重大專項項目(2012ZX1002D2DD；2013ZX100 05002)；國家自然科學(xué)基金項目(81272330；81202362)

Supported by National Science and Technology Major Project (2012ZX10 02D2DD; 2013ZX10005002); National Natural Science Foundation of China (81272330; 81202362)

馮帆，男，博士，主管藥師。研究方向：腫瘤藥理學(xué)。Email: fengfanbio@126.com

楊永平，男，碩士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主任。Email: yongpingyang@hotmail.com；史國兵，男，博士，主任藥師，博士生導(dǎo)師，主任。Email: guobingsh@163.com