細(xì)胞色素氧化酶3A4啟動子報(bào)告基因的構(gòu)建及其活性檢測

張 帆，司 文，高旭東，馮 帆，王春平，楊予濤，楊永平，楊俊蘭

1解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；2解放軍第三零二醫(yī)院 肝臟腫瘤診療與研究中心，北京 100039；3沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，遼寧沈陽 110016；4首都醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100071

細(xì)胞色素氧化酶3A4啟動子報(bào)告基因的構(gòu)建及其活性檢測

張 帆1，司 文1，高旭東2，馮 帆3，王春平2，楊予濤4，楊永平2，楊俊蘭1

1解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；2解放軍第三零二醫(yī)院 肝臟腫瘤診療與研究中心，北京 100039；3沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，遼寧沈陽 110016；4首都醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100071

目的建立細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome P-450，CYP)3A4啟動子報(bào)告基因并在孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞中檢測其轉(zhuǎn)錄活性。方法利用PCR擴(kuò)增CYP 3A4的啟動子區(qū)遠(yuǎn)端調(diào)控序列(-7836/-7208)和近端調(diào)控序列(-362/+52)序列；將上述序列克隆至pGL3-Promoter載體上；利用螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測CYP 3A4報(bào)告基因的活性。結(jié)果在肝癌細(xì)胞系中，PXR的激動劑利福平能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)遠(yuǎn)端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因(R2=0.92；P=0.003 4)和近端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因(R2=0.95；P=0.011)的活性，EC50為(5.65±0.58)μmol/L和(8.91±1.12)μmol/L；PXR的拮抗劑酮康唑能夠劑量依賴性地抑制利福平誘導(dǎo)的遠(yuǎn)端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因(R2=0.92；P=0.003 4)和PXRELuc(R2=0.92；P=0.003 4)活性，IC50為(0.55±0.08)μmol/L和(0.94±0.14)μmol/L。此外，多種化療藥物(PXR的潛在配體)能夠在PXR陽性的腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)遠(yuǎn)端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因和近端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因的活性。結(jié)論成功構(gòu)建了CYP 3A4啟動子報(bào)告基因，在此基礎(chǔ)上建立了在不同腫瘤細(xì)胞中檢測PXR轉(zhuǎn)錄活性的方法。

細(xì)胞色素氧化酶3A4；孕烷X受體；螢光素酶報(bào)告基因；轉(zhuǎn)錄活性

孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)在消化系統(tǒng)器官和腫瘤組織中分布廣泛，其結(jié)構(gòu)由轉(zhuǎn)錄激活的N-末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain， N-TD)、保守的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain，DBD)和高度可變的配體結(jié)合的C-末端結(jié)構(gòu)域(ligand binding domain，LBD)組成[1-6]。PXR與配體結(jié)合后能夠轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，介導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄[7]。多種內(nèi)/外源化學(xué)物質(zhì)被確定為PXR的配體，能夠誘導(dǎo)CYP3A4、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19等多種亞型的CYP 450轉(zhuǎn)錄[2-3]。其中，CYP 3A4是最為常見的分布廣泛的CYP 450亞型[3]。CYP 3A4的表達(dá)量及其催化活性是肝代謝活性等的標(biāo)志，能夠介導(dǎo)吉非替尼和索拉非尼等化療藥物的氧化代謝。本研究根據(jù)基因文庫的序列，選取CYP 3A4啟動子區(qū)域中含有PXR結(jié)合元件DR3和ER6的遠(yuǎn)端調(diào)控序列(-7836/-7208)，以及僅含有ER6位點(diǎn)的近端調(diào)控序列(-362/+52)，將上述兩段序列克隆到pGL3-啟動子載體上，構(gòu)建CYP 3A4報(bào)告基因，檢測其活性，為后續(xù)研究靶向藥物的代謝、清除及耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料 質(zhì)粒pGL3-Prpmopter和β-gal表達(dá)載體均由首都醫(yī)科大學(xué)楊予濤博士惠賜；胃癌BGC823、肝癌HepG2、大腸癌LS180、肺癌A549和乳腺癌MCF-7等細(xì)胞系均由本實(shí)驗(yàn)室保存；所用引物購自賽百盛(SBS)公司，使用pH 8.0的10 mmol/L Tris配置成200 μl溶液；Primary-STAR以及Taq等DNA聚合酶購自寶生物公司(TaKaRa)；限定性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ，以及T4-DNA連接酶購自New England Biolab公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒以及螢光素酶報(bào)告基因試劑盒等均購自Promega公司；含蛋白酶抑制劑(1∶500)的RIPA細(xì)胞裂解液、SDS-蛋白電泳Loading Buffer、蛋白Marker以及硝酸纖維素膜(NC膜)購自Bio-Rad公司；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)所用抗體購自Santa Cruz公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒(Qiangen公司)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin AMINE2000購自Invitrogen公司；CCK-8試劑和牛血清白蛋白購自Amerresco公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿及24孔培養(yǎng)板購自Corning公司；工具藥物利福平和酮康唑購自Sigma公司，分子靶向藥物索拉非尼和吉非替尼購自大連美侖公司，細(xì)胞毒性藥物紫杉醇和絲裂霉素購自Sigma公司，全部藥物均由質(zhì)譜確證其結(jié)構(gòu)正確，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測其純度＞98%，使用二甲亞砜配制成3 mmol/L的母液，4℃保存。

2 主要設(shè)備 PCR儀(ABI公司)；DNA電泳儀、SDS-PAGE電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；多功能酶標(biāo)儀(Wallac公司)；TS-100倒置相差顯微鏡(Nikon公司)。

3 CYP 3A4啟動子區(qū)序列的克隆 CYP 3A4啟動子區(qū)域中PXR的結(jié)合位點(diǎn)XREM(-7836/-7208)和PXRE(-362/+52)序列設(shè)計(jì)引物，以XhoⅠ和KpnⅠ為限定性內(nèi)切酶位點(diǎn)，擴(kuò)增XREM和PXRE序列，PCR產(chǎn)物回收、備用。所用引物：XREM Sense：5′-CGCTCGAGTCTAGAGAGATGGTTCATTCC-3′；Anti-sense 5′-CGGGTACCTCGTCAACAGGTTAAAG GAG-3′；PXRE Sense：5′-CGCTCGAGAGATCTGT AGGTGTGGCTTGTTGG-3′；Anti-sense 5′-CGGGTA CCTGTTGCTCTTTGCTGGGCTATGTGC-3′。

4 XREM-Luc和PXRE-Luc報(bào)告基因載體的構(gòu)建

將pGL3-Prpmopter載體和PCR產(chǎn)物使用XhoⅠ和KpnⅠ酶切4 ～ 6 h，瓊脂糖凝膠電泳回收，備用。使用T4連接酶進(jìn)行連接實(shí)驗(yàn)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪板、挑菌、擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切鑒定，測序。

5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 使用添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BGC823、HepG2、LS180、A549和MCF-7等細(xì)胞，用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞種于24孔板(80% ～ 90%密度)中，按照廠商說明書將XREM-Luc和PXRE-Luc，以及內(nèi)參β-gal質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相應(yīng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后的細(xì)胞，按照表1中所示藥物濃度梯度處理細(xì)胞。對于熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)，使用10 μmol/L利福平預(yù)處理細(xì)胞，再加入酮康唑；對于細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn)，則僅使用化療藥物。

6 XREM-Luc和PXRE-Luc報(bào)告基因活性的測定

按照王博等[8]的方法，測定報(bào)告基因的螢光素酶活性及內(nèi)參活性，在此基礎(chǔ)上計(jì)算相對活性和抑制率。計(jì)算公式：

相對活性(%)=(藥物處理組報(bào)告基因活性-溶劑對照組報(bào)告基因活性)/(藥物最大作用組報(bào)告基因活性-溶劑對照組報(bào)告基因活性)×100%[9]。

藥物作用抑制率(%)=(激動劑處理組報(bào)告基因活性-藥物處理組報(bào)告基因活性)/(激動劑處理組報(bào)告基因活性-溶劑對照組報(bào)告基因活性)×100%。

利用Origin 8.5軟件在此基礎(chǔ)上分別計(jì)算EC50和IC50值。

7 細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn) 按照張帆等[10]的方法，將腫瘤癌細(xì)胞系接種于24孔板中，待每孔細(xì)胞密度達(dá)到80% ～ 90%換新鮮培養(yǎng)基，每孔1 ml；配置化療藥物工作液，濃度梯度見表2，按照1∶1 000比例加入24孔板中(每孔1 μl)，化療藥物的終濃度見表2。孵育72 h后，每孔加入30 μl CCK-8試劑，孵育4 h后，多功能酶標(biāo)儀在450 nm 測定吸光度，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

抑制率(%) = (對照組A 450 nm -藥物處理組A 450 nm)/(對照組A 450 nm -溶劑對照組A 450 nm)×100%。

8 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 按照馮帆等[11]的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一抗稀釋條件：兔抗人PXR單抗（1∶2 000稀釋）；兔抗人GAPDH內(nèi)參多抗（1∶5 000稀釋），37℃孵育2 h。硝酸纖維素膜用TBST洗3次，二抗稀釋條件：辣根過氧化物酶-羊抗兔單克隆抗體(1: 5 000稀釋)，室溫孵育1 h。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用統(tǒng)計(jì)和繪圖軟件Origin 6.1中的Sigmoidal Fit模塊進(jìn)行回歸分析，擬合藥物作用的量效曲線并計(jì)算相應(yīng)IC50值和EC50值；使用Origin 6.1軟件中的Polymoidal Fit模塊擬合藥物作用曲線，并計(jì)算其R2值和P值。

表1 實(shí)驗(yàn)中工具藥物和化療藥物的濃度梯度設(shè)置Tab. 1 Concentrations of compounds used in concentration-response effect test

表2 實(shí)驗(yàn)中化療藥物濃度梯度設(shè)置Tab. 2 Concentrations of compounds used in concentration-response effect test

表3 在HepG2細(xì)胞中檢測CYP 3A4報(bào)告基因活性Tab. 3 Activity of CYP3A4 reporters in HepG2 cell

結(jié) 果

1 XREM-Luc和PXRE-Luc報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建 XREM-Luc和PXRE-Luc質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR鑒定，僅有成功插入XREM(圖1A)及PXRE (圖1B)序列的質(zhì)粒能夠擴(kuò)增出PCR條帶；對陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定(圖1C、圖1D)，符合結(jié)果預(yù)期。

2 XREM-Luc和PXRE-Luc載體的測序鑒定 對前述的陽性克隆進(jìn)行測序分析，表明所得序列(出示XREM-Luc和PXRE-Luc重組載體中，XREM和PXRE序列中的PXR結(jié)合位點(diǎn))無突變發(fā)生。見圖2。

3 XREM-Luc和PXRE-Luc的活性鑒定 PXR的激動劑利福平能夠在HepG2細(xì)胞中劑量依賴性地誘導(dǎo)XREM-Luc(R2=0.92；P=0.003 4)和PXRE-Luc (R2=0.95；P=0.011)活性。PXR的拮抗劑酮康唑能夠劑量依賴性地抑制PXR激動劑利福平誘導(dǎo)的XREM-Luc(R2=0.96；P=0.009 8)和PXRE-Luc(R2= 0.98；P=0.002 2)活性。這表明，構(gòu)建的CYP 3A4報(bào)告基因具有明確的活性。見圖3、表3。

4 化療藥物對XREM-Luc和PXRE-Luc活性誘導(dǎo)作用 PXR在胃癌BGC823、肝癌HepG2、大腸癌LS180、肺癌A549和乳腺癌MCF-7等細(xì)胞系中均有表達(dá)(圖4)。索拉非尼、吉非替尼、紫杉醇和絲列霉素能夠在BGC823、HepG2、LS180、A549和MCF-7細(xì)胞中劑量依賴地升高遠(yuǎn)端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因和近端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因的活性(表4 ～表5)。上述化療藥能夠在PXR陽性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)CYP3A4報(bào)告基因的活性，其誘導(dǎo)濃度與其作用(殺傷腫瘤細(xì)胞)濃度接近。見表6。

圖 1 重組CYP 3A4告基因的PCR和酶切鑒定A ～ B： PCR鑒定結(jié)果; C ～ D： 限定性內(nèi)切酶切鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果; A: XREM-Luc報(bào)告基因; B: PXRE-Luc報(bào)告基因Fig. 1 Identif i cation of CYP3A4 luciferase reporters via PCR assays and restriction endonuclease experiment A-B: PCR assays; C-D: restriction endonuclease experiment; A: XREM-Luc reporter; B: PXRE-Luc reporter

圖 2 重組PXR 應(yīng)答元件報(bào)告基因的測序鑒定A: XREM-Luc 報(bào)告基因; B: PXRE-Luc報(bào)告基因Fig. 2 Identif i cation of CYP3A4 luciferase reporters via DNA sequencing A: XREM-Luc reporter; B: PXRE-Luc reporter

圖 3 PXR在GC823、 HepG2、 LS180、 A549和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)鑒定A: A549轉(zhuǎn)染XREM-Luc表達(dá)載體后使用系列濃度梯度的利福平(PXR激動劑); B: A549轉(zhuǎn)染PXRE-Luc表達(dá)載體后使用系列濃度梯度的利福平; C: A549轉(zhuǎn)染XREM-Luc表達(dá)載體后使用10μmol/L 利福平后，再使用系列濃度梯度的酮康唑 (PXR拮抗劑)處理細(xì)胞; C: A549轉(zhuǎn)染XREM-Luc表達(dá)載體后使用10μmol/L 利福平后，再使用系列濃度梯度的酮康唑處理細(xì)胞; D: A549轉(zhuǎn)染PXRE-Luc表達(dá)載體后使用10μmol/L 利福平后，再使用系列濃度梯度的酮康唑處理細(xì)胞Fig. 3 Effect of PXR agonist and antagonist on XREM-Luc and PXRE-Luc activity A: A549 cells transfected with XREM-Luc and then treated with indicated concentrations of Rifampicin (agonist of PXR); B: A549 cells transfected with PXRE-Luc and then treated with indicated concentrations of Rifampicin (agonist of PXR); C: A549 cells transfected with XREM-Luc and then treated with indicated concentrations of Rifampicin (agonist of PXR) and Ketoconazole (antagonist of PXR); D: A549 cells transfected with PXRE-Luc and then treated with indicated concentrations of Rifampicin (agonist of PXR) and Ketoconazole (antagonist of PXR)

圖 4 PXR在BGC823、 HepG2、 LS180、 A549和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)鑒定Fig. 4 Expression of PXR in BGC823, HepG2, LS180, A549 and MCF-7 cells

表4 化療藥物在不同細(xì)胞中誘導(dǎo)XREM-Luc報(bào)告基因的活性Tab. 4 Activity of XREM-Luc reporter induced by chemotherapeutics

表5 化療藥物在不同細(xì)胞中誘導(dǎo)PXRE-Luc報(bào)告基因的活性Tab. 5 Activity of PXRE-Luc reporter induced by chemotherapeutics

表6 化療藥物作用于BGC823、HepG2、LS180、A549和MCF-7細(xì)胞的IC50值Tab. 6 Cytotoxicity activity of chemotherapeutics on BGC823, HepG2, LS180, A549 and MCF-7 cells

討 論

PXR不僅在消化系統(tǒng)腫瘤中分布廣泛，其下游基因MDR-1編碼和MRP-2/3能夠調(diào)控肺癌細(xì)胞的化療藥耐受；乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)能夠調(diào)控乳腺癌細(xì)胞系的化療藥耐受作用[12-13]。此外，PXR下游基因CYPs能夠介導(dǎo)化療藥的氧化代謝，CYP 3A4是最主要的CYPs亞型，能夠介導(dǎo)索拉非尼等分子靶向化療藥物的氧化代謝，影響其化療效果[14]。為研究CYP 3A4的功能以及對化療藥物的影響，本研究構(gòu)建了CYP 3A4的報(bào)告基因遠(yuǎn)端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因和近端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因。PXR的激動劑利福平能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)遠(yuǎn)端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因和近端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因的活性(表3)；PXR的拮抗劑酮康唑能夠劑量依賴性地抑制利福平誘導(dǎo)的遠(yuǎn)端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因和近端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因的活性(表3)。這表明本研究成功構(gòu)建了CYP 3A4報(bào)告基因，建立了利用CYP 3A4報(bào)告基因檢測PXR轉(zhuǎn)錄活性的方法。

PXR/CYP3A4在乳腺癌、肝癌等多種腫瘤組織中均有表達(dá)。紫杉醇、絲裂霉素和喜樹堿等化療藥以及利福平等抗生素都能夠誘導(dǎo)PXR的活性并介導(dǎo)CYP 3A4和CYP 2B6等型CYPs的表達(dá)[1-2]。另有報(bào)道稱，多種蛋白激酶抑制劑：吉非替尼、伊馬替尼、拉帕替尼以及舒尼替尼等也能夠誘導(dǎo)PXR的活性[15-17]。因此，藥物代謝系統(tǒng)可能是腫瘤細(xì)胞原發(fā)性/誘導(dǎo)性多藥耐藥的新作用機(jī)制。為此，本研究選取了代表性細(xì)胞毒性化療藥物：紫杉醇和絲列霉素，以及小分子蛋白激酶抑制劑索拉非尼和吉非替尼，在PXR表達(dá)陽性的乳腺癌、肝癌、肺癌、大腸癌和胃癌細(xì)胞系中檢測其對CYP 3A4報(bào)告基因活性的影響(表4 ～表5)。結(jié)果顯示，上述藥物均能夠誘導(dǎo)遠(yuǎn)端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因和近端調(diào)控序列熒光素酶報(bào)告基因的活性(表4 ～表5)。進(jìn)一步，我們得到了上述藥物作用于所選細(xì)胞系的IC50值(表6)，發(fā)現(xiàn)小分子蛋白激酶抑制劑誘導(dǎo)PXR活性的濃度與其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用濃度基本相當(dāng)，而細(xì)胞毒性化療藥誘導(dǎo)PXR活性的濃度比其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用濃度略高。

本研究進(jìn)一步拓展了對藥物代謝和清除系統(tǒng)調(diào)控腫瘤細(xì)胞癌化療藥物多藥耐受的認(rèn)識，對深入理解其分子機(jī)制以及化療藥物臨床耐藥的檢測指標(biāo)具有重要臨床意義；也為今后開發(fā)新的腫瘤化藥治療策略提供更多選擇。

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Construction of CYP 3A4 luciferase reporters and their transcription activity

ZHANG Fan1, SI Wen1, GAO Xudong2, FENG Fan3, WANG Chunping2, YANG Yutao4, YANG Yongping2, YANG Junlan11Department of Medical Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Center for Liver Cancer, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China;3Department of Pharmacy, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;4Beijing Institute for Neuroscience, Beijing 100071, China

s: YANG Yongping. Email: yongpingyang@hotmail.com; YANG Junlan. Email: yangjunlan1123@126.com

Objective To construct the cytochrome P-450 (CYP) 3A4 luciferase reporters and test their transcription activity in the positive tumor cells expressed by pregnane X receptor (PXR). Methods The sequences of XREM (-7836/-7208) and PXRE (-362/+52) in CYP 3A4 promoter were amplif i ed via PCR method, and then they were cloned into pGL3-Promoter vectors. The activity of CYP 3A4 reporters was measured by luciferase assay. Results The Rifampicin, which was the agonist of PXR, induced the activity of XREM-Luc (R2=0.92; P=0.003 4) and PXRE-Luc (R2=0.95; P=0.011) in a dose dependent manner, with the EC50value of 5.65±0.58 μmol/L and 8.91±1.12 μmol/L, respectively. The Ketoconazole, which was the antagonist of PXR, inhibited the activity of XREM-Luc (R2=0.92; P=0.003 4) and PXRE-Luc (R2=0.92; P=0.003 4) induced by Rifampicin in a dose dependent manner, with the IC50value of 0.55±0.08 μmol/L and 0.94±0.14 μmol/L, respectively. In addition, the effect of some potential PXR's ligands on CYP 3A4 reporters could be examined in the cells expressed by PXR. Conclusion The construction of the CYP 3A4 reporters is successfully established, which lays foundation for further functional study of CYP 3A4.

cytochrome P-450 3A4; pregnane X receptor; luciferase reporters gene; transcriptional activity

R 73-3

A

2095-5227(2015)02-0160-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.018

時(shí)間：2014-10-11 16:51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141011.1651.003.html

2014-08-12

國家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2012ZX1002D2DD；2013ZX100 05002)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81272330；81202362)

Supported by the National Science and Technology Major Project (2012ZX 1002D2DD; 2013ZX10005002); National Natural Science Foundation of China (81272330; 81202362)

張帆，女，博士，主治醫(yī)師。研究方向：腫瘤學(xué)。Email: zfzhangfan10@126.com

楊永平，男，碩士，主任醫(yī)師，主任。Email: yongping yang@hotmail.com；楊俊蘭，女，碩士，主任醫(yī)師。Email: yangjunlan 1123@126.com