癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬中食欲素受體1隨時(shí)間演變的規(guī)律

陳亞楠，朱 飛，楊 楠，左萍萍，李瑞生，郎森陽(yáng)，王湘慶

1解放軍總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853；2北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院藥理室，北京 100005；3解放軍第302醫(yī)院 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，北京 100039

癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬中食欲素受體1隨時(shí)間演變的規(guī)律

陳亞楠1，朱 飛1，楊 楠2，左萍萍2，李瑞生3，郎森陽(yáng)1，王湘慶1

1解放軍總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853；2北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院藥理室，北京 100005；3解放軍第302醫(yī)院 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，北京 100039

目的探討癲癇持續(xù)狀態(tài)后癲癇模型大鼠海馬中食欲素受體1 (orexin receptor-1，OX1R)隨時(shí)間演變的規(guī)律。方法實(shí)驗(yàn)3月齡雄性Wistar大鼠100只，體質(zhì)量250 ～ 400 g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(KA組)和對(duì)照組(NS組)，實(shí)驗(yàn)組采用海人酸(kainic acid，KA)腹腔注射誘導(dǎo)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的模型，在癲癇持續(xù)狀態(tài)30 min后終止發(fā)作，分別于終止發(fā)作后4 h、1 d、1周、1個(gè)月、2個(gè)月處死大鼠，對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，處理同實(shí)驗(yàn)組，隨后行免疫組化染色和Western-blot方法檢測(cè)OX1R的變化。結(jié)果兩種檢測(cè)方法均提示實(shí)驗(yàn)組(KA組)和對(duì)照組(NS組)隨著鼠齡(3 ～ 5個(gè)月)的增加，海馬內(nèi)OX1R表達(dá)均隨呈上升趨勢(shì)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)KA組海馬各區(qū)OX1R的表達(dá)均高于NS組，但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P ＞ 0.05)。結(jié)論在癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠及對(duì)照組大鼠中，海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及齒狀回(dentate gyrus，DG) OX1R的表達(dá)與癲癇發(fā)作無(wú)相關(guān)性，但隨著鼠齡的增長(zhǎng)海馬各區(qū)OX1R的表達(dá)均隨時(shí)間呈增多趨勢(shì)，提示隨鼠齡增加海馬OX1R表達(dá)逐漸增多。

癲癇持續(xù)狀態(tài)；大鼠；海馬；食欲素受體1

癲癇為神經(jīng)科常見(jiàn)疾病，以反復(fù)發(fā)作為特點(diǎn)，對(duì)認(rèn)知和記憶均有損害，且癲癇持續(xù)狀態(tài)為急危重癥，具有較高的死亡率和致殘率[1-2]。食欲素(Orexin)為一種神經(jīng)肽，包括Orexin-A和Orexin-B(也被稱(chēng)作下丘腦分泌素1和下丘腦分泌素2)，可以通過(guò)與其相應(yīng)的食欲素受體1 (orexin receptor-1，OX1R)和食欲素受體2 (orexin receptor-1，OX2R)結(jié)合參與機(jī)體的能量代謝、攝食、睡眠-覺(jué)醒周期的調(diào)控[3-4]。食欲素系統(tǒng)中OX1R和OX2R均為G蛋白偶聯(lián)受體，Orexin-A選擇性地與OX1R相結(jié)合而發(fā)揮其相應(yīng)的作用，其中OX1R對(duì)配體有嚴(yán)格的選擇性(其配體主要為Orexin-A)，而OX2R則對(duì)配體(Orexin-A或Orexin-B)沒(méi)有嚴(yán)格的選擇性[5]。曾認(rèn)為分泌的食欲素神經(jīng)元僅存在于下丘腦中[6]，而Morales等[7]和陳福順等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在海馬中也存在Prepro-OX mRNA的表達(dá)，且在匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)后的1 ～ 3 d內(nèi)表達(dá)上調(diào)，表明食欲素系統(tǒng)與癲癇之間可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。食欲素主要通過(guò)與OX1R或OX2R相結(jié)合形成突觸傳遞系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮其與飲食、交感神經(jīng)活動(dòng)、睡眠與覺(jué)醒狀態(tài)以及癲癇等相關(guān)的生理作用[9]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，反復(fù)癲癇發(fā)作患者腰穿腦脊液中Orexin-A濃度較非癲癇患者降低，提示Orexin-A可能與癲癇發(fā)作有一定聯(lián)系。Orexin-A主要作用于OX1R，其結(jié)合能力約為OX2R的10倍[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Orexin-A與癲癇有一定聯(lián)系，而OX1R為Orexin-A較為重要的受體，所以我們以O(shè)X1R作為研究對(duì)象，旨在進(jìn)一步探索食欲素系統(tǒng)參與癲癇發(fā)作的機(jī)制。

材料和方法

1 主要儀器和試劑 冷凍切片機(jī)為L(zhǎng)ei CA CM 1900，Olympus BX53顯微鏡，海人酸(kainic acid，KA)(編號(hào)K0250)購(gòu)自Sigma公司，Anti-Orexin Receptor 1 antibody (編號(hào)ab68718)購(gòu)自Abcam公司，超敏即用型二步法(非生物素)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 動(dòng)物分組及模型制作 3月齡雄性Wistar大鼠100只，體質(zhì)量250 ～ 400 g，由解放軍第302醫(yī)院動(dòng)物中心提供。本實(shí)驗(yàn)符合衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理指導(dǎo)意見(jiàn)和解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)有關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)，供應(yīng)充足的飼料和水，供動(dòng)物自由攝取。動(dòng)物房室溫22℃，濕度20% ～ 30%，12 ～ 12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)適應(yīng)1周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(KA組)和對(duì)照組(NS組)。按動(dòng)物體質(zhì)量大小編號(hào)，隨機(jī)分為5組，每組5只。1)KA組：經(jīng)腹腔注射KA(8 mg/kg)誘發(fā)急性癲癇發(fā)作，持續(xù)發(fā)作30 min后給予地西泮(1 mg/kg)終止發(fā)作，按發(fā)作后時(shí)間點(diǎn)分為4 h、1 d、1周、1個(gè)月、2個(gè)月組；2)NS組：與實(shí)驗(yàn)組相對(duì)應(yīng)地分為4 h、1 d、1周、1個(gè)月、2個(gè)月組，在相同時(shí)間給予腹腔注射等量的0.9%氯化鈉注射液(normal saline，NS)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的子組根據(jù)其時(shí)間分組的情況分別在4 h、1 d、1周、1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)處死，行免疫組化染色和Western-Blot法檢測(cè)OX1R的表達(dá)情況。

3 大鼠癲癇分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 觀(guān)察并采用錄像機(jī)監(jiān)測(cè)大鼠癲癇發(fā)作程度及發(fā)作時(shí)間。發(fā)作程度按Racine標(biāo)準(zhǔn)分5級(jí)：1級(jí)：眨眼、豎毛，胡須抖動(dòng)、嗅、面部抽搐；2級(jí)：點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)(頸部肌肉抽搐)、咀嚼運(yùn)動(dòng)、嚴(yán)重面部肌肉痙攣；3級(jí)：一側(cè)前肢抬起，輕微陣攣；4級(jí)：用后肢站起伴有兩側(cè)前肢的陣攣；5級(jí)：站立、雙側(cè)前肢陣攣加重，失去平衡跌倒伴全身陣攣即在4級(jí)的基礎(chǔ)上身體向后倒下。評(píng)分在4級(jí)或以上者為造模成功[10]。

4 免疫組織化學(xué)染色測(cè)海馬OX1R神經(jīng)纖維的分布及密度 用2%硫噴妥鈉(50 mg/kg)將大鼠麻醉后，取大鼠腦組織，置于4%多聚甲醛中放置1周，采用15%、20%、25%、30%的蔗糖溶液梯度脫水，待腦組織脫水后，根據(jù)Paxinos大鼠圖譜定位神經(jīng)核團(tuán)，修出海馬所在的腦組織，固定后行35 μm的冠狀位連續(xù)切片，將切片置于含有凍存液的12孔板中于-20℃保存，每孔25張。每只動(dòng)物選取3 ～ 4片組織切片，選取對(duì)耳線(xiàn)5.7 ～ 6.7 mm內(nèi)的切片。隨后進(jìn)行免疫組化染色，染色后采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)定量測(cè)定每張切片海馬CA1、CA3和齒狀回的OX1R的神經(jīng)纖維的積分光密度值(integral optical density，IOD)。

5 Western-blot印跡法測(cè)海馬OX1R的表達(dá) 將大鼠采用2%硫噴妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，直接斷頭取腦，迅速取出海馬組織放入標(biāo)記好的凍存管內(nèi)，至于液氮內(nèi)冰凍，之后放入-80℃保存。進(jìn)行蛋白定量并計(jì)算出每個(gè)樣品的上樣體積，根據(jù)所需的量，煮蛋白使之變性，置于-20℃保存。隨后可取蛋白進(jìn)行Western-blot印跡法進(jìn)行檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析圖片，計(jì)算海馬OX1R和β-actin的條帶密度比值。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用-x±s表示，單因素方差分析、獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α= 0.05。

結(jié) 果

圖 1 KA組和NS組OX1R積分光密度值在海馬CA1、CA3及DG的變化趨勢(shì)Fig. 1 Changes of IOD in CA1, CA3 and DG of hippocampus between KA group and NS group

1 OX1R在海馬CA1區(qū)表達(dá) OX1R的積分光密度值在兩組海馬CA1區(qū)呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢(shì)，KA組在4 h、1 d、1周、1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)均高于NS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；時(shí)間點(diǎn)1 d、1周分別與同組內(nèi)4 h時(shí)OX1R的表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，1個(gè)月、2個(gè)月與4 h組內(nèi)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的OX1R的積分光密度值對(duì)比結(jié)果及變化趨勢(shì)分別見(jiàn)表1和圖1，免疫組化染色見(jiàn)圖2。

2 OX1R在海馬CA3區(qū)的表達(dá) 兩組OX1R的積分光密度值均呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，KA組在4 h、1 d、 1周、1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)均高于NS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P＞0.05)；1 d、1周分別與同組內(nèi)4 h時(shí)OX1R的分布情況相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，1個(gè)月、2個(gè)月與4 h組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2和圖1，免疫組化染色見(jiàn)圖3。

圖 2 KA組和NS組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)免疫組化染色(左圖為KA組，右圖為NS組)Fig. 2 Immunohistochemistry of the CA1 of hippocampus (×10) in different time in KA group and NS group (Left: KA group; Right: NS group)

圖 3 KA組和NS組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA3區(qū)免疫組化染色(左圖為KA組，右圖為NS組)Fig. 3 Immunohistochemistry of the CA3 of hippocampus (×10) in different time in KA group and NS group (Left: KA group; Right: NS group)

圖 4 KA組和NS組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬DG區(qū)免疫組化染色(左圖為KA組，右圖為NS組)Fig. 4 Immunohistochemistry of the DG of hippocampus (×10) in different time in KA group and NS group (Left: KA group; Right: NS group)

3 OX1R在海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)的表達(dá) 兩組中OX1R的積分光密度值在海馬DG區(qū)呈現(xiàn)持續(xù)升高趨勢(shì)，KA組在4 h、1 d、1周、1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)均高于NS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P＞0.05)；KA組和NS組內(nèi)1 d與4 h之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，1周、1個(gè)月、2個(gè)月與4 h組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3和圖1，免疫組化染色見(jiàn)圖4。

4 Western-blot結(jié)果 兩組大鼠海馬中OX1R表達(dá)均呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，KA組在各時(shí)間點(diǎn)均稍高于NS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P＞0.05)；KA組內(nèi)1 d、1周、1個(gè)月與4 h之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，2個(gè)月與4 h組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；NS組中各時(shí)間點(diǎn)雖均高于4 h組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表4，Western-blot見(jiàn)圖5。

表1 KA組和NS組OX1R在海馬CA1區(qū)的積分光密度值的比較Tab. 1 Changes of IOD in CA1 of hippocampus between KA group and NS group

表2 KA組和NS組OX1R在海馬CA3區(qū)的積分光密度值的比較Tab. 2 Changes of IOD in CA3 of hippocampus between KA group and NS group

表3 KA組和NS組OX1R在海馬DG區(qū)的積分光密度值的比較Tab. 3 Changes of IOD in DG 1 of hippocampus between KA group and NS group

表4 KA組和NS組OX1R在海馬的表達(dá)比較Tab. 4 Changes of the OX1R in hippocampus between KA group and NS group

圖 5 Western-blot檢測(cè)大鼠海馬中OX1R表達(dá)水平Fig. 5 Western-blot showing expression level of OX1R in hippocampus

討 論

癲癇是由神經(jīng)環(huán)路的損害而導(dǎo)致的反復(fù)神經(jīng)元異常放電所引起的一種疾病，其發(fā)作和終止的機(jī)制尚未完全明確，可能與多種神經(jīng)突觸相關(guān)。癲癇可反復(fù)發(fā)作，且可以對(duì)患者的學(xué)習(xí)和認(rèn)知造成損害[11]。食欲素A已證實(shí)和學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)，癲癇發(fā)作后所引起的記憶力下降可能與Orexin-A減少有關(guān)[12]。目前有研究證明，食欲素在獎(jiǎng)勵(lì)系統(tǒng)和成癮行為上有著重要的作用，已在行為、解剖及神經(jīng)生理研究中證實(shí)外側(cè)丘腦與獎(jiǎng)勵(lì)機(jī)制和成癮行為密切相關(guān)[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，KA組與NS組中OX1R在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及齒狀回的分布均隨時(shí)間呈逐漸升高趨勢(shì)，KA組大鼠海馬中OX1R的分布均稍高于NS組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P＞0.05)，隨著鼠齡的增長(zhǎng)OX1R表達(dá)逐漸增多，表明OX1R的分布可能與年齡呈正相關(guān)；免疫組化結(jié)果中提示KA組和NS組中大鼠CA1區(qū)、CA3區(qū)OX1R分布在1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)與開(kāi)始(4 h)時(shí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，在海馬齒狀回1周、1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)OX1R的分布與開(kāi)始(4 h)時(shí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。陳福順等研究證明，Orexin-A可能參與癲癇的發(fā)生發(fā)展，但本研究結(jié)果并未得出此結(jié)論。Hervieu等[15]研究顯示，匹羅卡品誘發(fā)癲癇病灶行程中有中間神經(jīng)元和星形細(xì)胞參與，在海馬可能由OX1/OX2受體介導(dǎo)上述過(guò)程。本研究結(jié)果提示，在癲癇持續(xù)狀態(tài)終止后，大鼠海馬各區(qū)的OX1R并未隨著癲癇發(fā)作時(shí)間而改變，與Hervieu等[15]的結(jié)論不一致，我們發(fā)現(xiàn)OX1R的變化趨勢(shì)與鼠齡的增長(zhǎng)有一定的相關(guān)性，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

Haj-Dahmane和Shen[16]研究Orexin的鎮(zhèn)痛作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)食欲素系統(tǒng)中的另一個(gè)成員Orexin-B可以誘導(dǎo)抑制谷氨酸的釋放，陳福順等[17]也證明在海人酸誘導(dǎo)的癲癇模型中Orexin-B其可能參與了癲癇的神經(jīng)元放電和傳播的調(diào)節(jié)，增加其濃度有助于對(duì)癲癇的控制。所以食欲素系統(tǒng)中參與癲癇的控制主要因素是否為Orexin-B需進(jìn)一步的研究證實(shí)。食欲素已證實(shí)與多種機(jī)體行為相關(guān)，關(guān)于食欲素參與癲癇發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及主要因素仍有待于更深入的研究。

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Changes over time of orexin receptor-1 in hippocampus of status epilepticus rats

CHEN Ya'nan1, ZHU Fei1, YANG Nan2, ZUO Pingping2, LI Ruisheng3, LANG Senyang1, WANG Xiangqing11Department of Neurology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Pharmacology, Institute of Basic Medical Science Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100005, China;3Animal Laboratory Center, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

WANG Xiangqing. Email: bjxqwang@yahoo.com.cn; LANG Senyang. Email: langsy@263.net

Objective To explore the changes over time of orexin receptor 1 (OX1R) in hippocampus of status epilepticus (SE) rats. Methods One hundred male Wistar rats were divided into model group (KA group) and control group (NS group). Models of SE rats were induced by intraperitoneal injection of kainic acid (KA), SE was terminated 30 minutes later. The rats in control group were injected with 0.9% sodium chloride injection intraperitoneally. Then the changes of OX1R were detected by immunohistochemistry and Western-blot at 4 h, 1 d, 1 week, 1 month, 2 months after the termination of SE in KA group and NS group. Results OX1R in hippocampus of SE rats increased gradually with age in model (KA) and control (NS) group, the IOD of OX1R in KA group was higher than that of NS group, but no signif i cant difference was found between the two groups. Conclusion In the KA and NS group, the changes of OX1R in CA1, CA3 and dentate gyrus (DG) of hippocampus in SE rats or controls are not associated with SE, but the expression of OX1R increases with time which suggests that OX1R increases with the age of rats.

status epilepticus; rats; hippocampus; orexin receptor-1

R 742.1

A

2095-5227(2015)02-0155-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.017

時(shí)間：2014-09-29 17:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140929.1705.002.html

2014-07-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81271438)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81271438)

陳亞楠，女，本科。專(zhuān)業(yè)方向：神經(jīng)病學(xué)。Email: chen yanan7722@163.com

王湘慶，女，博士，副主任醫(yī)師。Email: bjxqwang@yahoo. com.cn；郎森陽(yáng)，女，博士，主任醫(yī)師。Email: langsy@263.net