熱打擊對大鼠肺組織血管內(nèi)皮生長因子A的影響

楊文超，高鐵嬰，胡 婕，李瑞生，趙佳佳，周京江，宋 青

1解放軍總醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2解放軍第302醫(yī)院 動物實驗中心，北京 100039

熱打擊對大鼠肺組織血管內(nèi)皮生長因子A的影響

楊文超1，高鐵嬰1，胡 婕1，李瑞生2，趙佳佳1，周京江1，宋 青1

1解放軍總醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100853；2解放軍第302醫(yī)院 動物實驗中心，北京 100039

目的研究熱打擊對大鼠肺組織血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)及相關(guān)細胞因子的影響。方法雄性SD大鼠30只，隨機分為空白對照組(n=10)，熱打擊+恢復(fù)15 min組(n=10)，熱打擊+恢復(fù)3 h組(n=10)。熱打擊組大鼠麻醉后置于高溫高濕模擬環(huán)境中，肛溫達到42℃后置于室溫分別恢復(fù)15 min及3 h。酶聯(lián)免疫法(Elisa)測各組大鼠肺組織勻漿VEGF-A及相關(guān)細胞因子水平。結(jié)果熱打擊+恢復(fù)15 min組VEGF-A、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)水平較空白對照組顯著升高，熱打擊+恢復(fù)3 h組VEGF-A、TGF-β1水平較空白對照組顯著降低，且VEGF-A水平與TGF-β1水平呈直線回歸關(guān)系。熱打擊+恢復(fù)3 h組促炎細胞因子TNF-α水平略高于熱打擊+恢復(fù)15 min組和空白對照組。3組大鼠促炎細胞因子IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論熱打擊早期大鼠肺組織VEGF-A水平短暫升高后，下降至正常水平以下，可能成為熱打擊后大鼠急性肺損傷發(fā)病初始階段的重要環(huán)節(jié)，且該變化可能僅與熱直接損傷有關(guān)。

熱打擊；肺；血管內(nèi)皮生長因子A

熱射病是機體暴露在高溫、高濕環(huán)境中，核心體溫迅速升高伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為特征的致命性急癥，發(fā)病后迅速出現(xiàn)全身炎性反應(yīng)綜合征及多器官功能衰竭，病情重、病死率高[1-3]。臨床上，75%熱射病患者出現(xiàn)多器官功能障礙，其中呼吸窘迫綜合征極為常見，為發(fā)病后熱直接損傷和急性炎性損傷所致[4]。在熱射病死亡病例中，14%的患者伴有呼吸衰竭[5]。動物實驗證明，熱打擊后肺組織出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)、肺間質(zhì)水腫和出血[4,6-8]。血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)通過增加血管通透性，促進內(nèi)皮細胞增殖、血管生成、血管新生，防止細胞凋亡，募集單核細胞等過程調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能，在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征前期肺水腫及后期組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，其表達和功能與病程進展、上皮細胞及內(nèi)皮細胞損傷程度有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factoralpha，TNF-α)、白細胞介素6(inter-leukin-6，IL-6)參與并上調(diào)肺組織VEGF-A表達[9]。熱射病多為散發(fā)病例，發(fā)病率較低，大樣本臨床研究較困難，因此多應(yīng)用動物實驗進行。此外，熱射病急性肺損傷過程中關(guān)于VEGF-A的研究國內(nèi)外尚屬空白。為此，我們設(shè)計了本實驗，旨在通過研究熱打擊后大鼠肺組織VEGF-A及相關(guān)細胞因子的變化，初步探討VEGF-A在熱射病早期急性肺損傷中的作用。

材料和方法

1 實驗對象 健康雄性Sprague-Dwley大鼠30只，12 ～ 14周齡，體質(zhì)量(205±25) g，SPF級，由解放軍第302醫(yī)院提供，分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d(使用動物合格證書編號為軍動管字第2014022191號)，溫度(23±1)℃，濕度(40±5)%，燈光照明，12 h晝夜節(jié)律變化。實驗過程中遵守實驗動物倫理原則，關(guān)注動物福利，愛護動物，盡可能減少對動物的損害。

2 主要儀器和試劑 自制環(huán)境模擬艙，動物肛溫表，定時秒表，離心機，電動勻漿器，EP管。PBS液，苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，ELISA檢測試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)：VEGF-A(ERC103.96)，TGF-β1(ERC107b.96)，TNF-α(ERC102a.96)，IL-6(ERC003.96)。

3 實驗分組與熱打擊模型建立 實驗前12 h禁食不禁水。實驗動物按隨機數(shù)字表法隨機分為空白對照組(n=10)和熱打擊組(n=20)。空白對照組始終置于室溫環(huán)境[溫度(23±1)℃，濕度(40±5)%]中。熱打擊組10%水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉后，置于溫度(37.5±0.5)℃、濕度(65±5)%的模擬環(huán)境中，監(jiān)測核心體溫至達到42℃后，將熱打擊組隨機分為2組，分別為熱打擊+恢復(fù)15 min組(n=10)、熱打擊+恢復(fù)3 h組(n=10)[10-12]。熱打擊組核心體溫達到42℃時轉(zhuǎn)移至室溫環(huán)境中恢復(fù)，并在相應(yīng)時間點處死動物。空白對照組10%水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉后測核心體溫處死。

4 核心體溫監(jiān)測 使用動物肛溫表測量肛溫作為核心體溫，記為Tc(℃)。Tc＜41℃時，每15 min測量1次；Tc＞41℃時，每5 min測量1次，直至造模成功，并記錄造模時間(min)。

5 肺組織VEGF-A及相關(guān)細胞因子檢測各組大鼠均在10%水合氯醛麻醉下頸動脈取血處死。剪取適量右肺下葉同一區(qū)域組織置于2 ml EP管中，加入500 μl遇冷PBS，加入終濃度為1 mmol/L的PMSF，電動勻漿器勻漿10 s×3次，冰上放置20 min。4℃，15 000 r/m離心20 min。離心后，收集上清液，BCA蛋白定量測定各個樣本的蛋白濃度，用PBS將各個樣本的蛋白調(diào)整為蛋白濃度一致(5 mg/ml)，Elisa檢測VEGF-A、TGF-β1、TNF-α、IL-6濃度。

6 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS13.0進行分析。計量資料以-x±s表示，采用完全隨機設(shè)計的方差分析，SNK-q檢驗法進行多重比較。Pearson相關(guān)描述兩變量相關(guān)關(guān)系并做直線回歸分析。兩組樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況 各組大鼠體質(zhì)量、造模前體溫、造模成功體溫、造模時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2 熱打擊對肺組織VEGF-A的影響 熱打擊+恢復(fù)15 min組VEGF-A水平顯著高于空白對照組(P＜0.05)，熱打擊+恢復(fù)3 h組VEGF-A水平顯著低于空白對照組(P＜0.05)，熱打擊+恢復(fù)3 h組VEGF-A水平顯著低于熱打擊+恢復(fù)15 min組(P＜0.05)。見表2。

3 熱打擊對肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-6的影響 熱打擊+恢復(fù)15 min組TGF-β1水平顯著高于空白對照組(P＜0.05)，熱打擊+恢復(fù)3 h組TGF-β1水平顯著低于空白對照組(P＜0.05)，熱打擊+恢復(fù)3 h組TGF-β1水平顯著低于熱打擊+恢復(fù)15 min組(P＜0.05)。熱打擊+恢復(fù)3 h組TNF-α水平略高于熱打擊+恢復(fù)15 min組和空白對照組(P＜0.05，P＜0.05)，但熱打擊+恢復(fù)15 min組TNF-α水平與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。3組大鼠IL-6水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、核心體溫、造模時間比較Tab. 1 Weight, Tc and time of HS in each group?

HS: heat stress; Tc: core temperature

表2 熱打擊對肺組織VEGF-A及相關(guān)細胞因子的影響Tab. 2 Effect of heat stress on VEGF-A and related molecules?

aP＜0.05 vs non-HS group;bP＜0.05 vs HS + 15 min group

4 相關(guān)性分析 VEGF-A水平與TGF-β1水平呈直線回歸關(guān)系(r=0.963，P=0.000；見圖1)，VEGF-A水平與TNF-α、IL-6水平無相關(guān)關(guān)系。

圖 1 VEGF-A與TGF-β1直線相關(guān)及直線回歸分析Fig. 1 Linear correlation and linear regression analysis of VEGF-A and TGF-β1 a: intercept; b: coefficient of regression; r: correlation coeff i cient

討 論

VEGF-A是血管內(nèi)皮生長因子蛋白家族的一員，與血管內(nèi)皮細胞膜結(jié)合受體(VEGFR-1和VEGFR-2)結(jié)合調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能[13-14]。原位雜交表明，人和動物肺組織VEGF-A主要來源為Ⅱ型肺泡上皮細胞和間質(zhì)細胞[15]。急性炎癥時，巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞也成為肺內(nèi)VEGF-A的重要來源[15]。TGF-β1廣泛表達于氣道上皮細胞，強烈刺激非內(nèi)皮細胞表達和釋放VEGF-A[16]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，熱打擊后15 min大鼠肺組織VEGF-A、TGF-β1水平較空白對照組顯著升高，且二者呈強烈直線相關(guān)關(guān)系(r=0.963，P=0.000)，該結(jié)果提示熱打擊15 min即出現(xiàn)氣道上皮細胞動員分泌TGF-β1增加，刺激Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺間質(zhì)細胞分泌VEGF-A。

TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中最早出現(xiàn)且最重要的多功能炎癥因子之一，主要由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生[17]。肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)是構(gòu)成肺部防御病原微生物和其他損傷因素的第一道防線。然而AM的功能與其他部位的巨噬細胞存在一定差異：一方面，AM具有更強的吞噬異物的能力，增加了多效性細胞因子TNF-α、活性氧簇、活性氮的產(chǎn)生；另一方面，它們減少了促炎細胞因子IL-6的釋放，本實驗中IL-6始終未出現(xiàn)明顯變化可能與此有關(guān)[18]。雖然TNF-α在肺急性炎癥時可上調(diào)VEGF-A水平，但熱打擊后15 min其水平較空白對照組無明顯差異，且與VEGF-A水平無相關(guān)關(guān)系，提示熱打擊早期肺內(nèi)尚未出現(xiàn)TNF-α大量分泌與廣泛浸潤[9]。由上可推測，熱打擊后15 min肺VEGF-A水平升高僅與TGF-β1的調(diào)節(jié)有關(guān)，而與促炎因子TNF-α、IL-6關(guān)系甚微，進一步可知，該階段肺內(nèi)促炎反應(yīng)可能尚未啟動，仍需進一步實驗證實。

Maitre等[19]觀察感染致急性肺損傷大鼠模型，在急性肺損傷初始階段(4 h)，肺組織VEGF-A水平較空白對照組降低。我們也觀察到，熱打擊后3 h，大鼠肺組織TGF-β1、VEGF-A水平較空白對照組顯著降低，二者呈強烈直線相關(guān)(r=0.963，P=0.000)。在熱打擊3 h時，VEGF-A水平的減少可能有以下兩個原因：一是熱直接損傷Ⅱ型肺泡上皮細胞、肺間質(zhì)細胞和(或)氣道上皮細胞導(dǎo)致TGF-β1、VEGF-A生成減少；二是細胞熱應(yīng)激后分泌TGF-β1、VEGF-A功能受到抑制，具體機制有待進一步研究。同時在該階段，IL-6水平無明顯變化，TNF-α輕微升高，提示該階段肺內(nèi)仍未出現(xiàn)明顯的促炎反應(yīng)，而TNF-α輕微升高可能與肺泡巨噬細胞開始活化有關(guān)。

目前認為，急性肺損傷早期，TGF-β1、TNF-α、IL-6等誘導(dǎo)VEGF-A表達和分泌增加，后者作用于血管內(nèi)皮細胞，增大血管通透性，促成肺水腫。隨著肺水腫進一步發(fā)展，肺泡上皮層廣泛損傷，VEGF-A水平下降；此外，細菌和病毒感染、酸吸入、高濃度氧吸入等原發(fā)因素均可直接損傷肺組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致VEGF-A表達減少。急性肺損傷恢復(fù)階段，肺泡上皮細胞修復(fù)，VEGF-A分泌增加，并通過其相應(yīng)受體參與血管新生，成為肺組織修復(fù)的重要組成部分[9]。臨床上，急性呼吸窘迫征患者支氣管肺泡灌洗液中VEGF-A減少，且在病情進展過程中，上皮表面襯液VEGF-A增加的患者預(yù)后較好[20-24]。結(jié)合本實驗熱打擊早期VEGF-A短暫升高后，顯著下降至正常水平以下的結(jié)果可以推測，早期肺VEGF-A水平的變化可能成為影響熱射病患者預(yù)后的因素之一。我們還觀察到，熱打擊后VEGF-A與由氣道上皮細胞分泌的TGF-β1變化同步，而與促炎因子TNF-α、IL-6關(guān)系甚微，由此推斷熱打擊早期VEGF-A水平的變化可能僅與原位分泌及熱直接損傷上皮細胞有關(guān)，而與肺內(nèi)促炎反應(yīng)無關(guān)，這與Leon等[25]觀察到熱打擊恢復(fù)期3 h開始出現(xiàn)血漿促炎細胞因子濃度升高的病生過程相吻合。

本實驗首次將VEGF-A引入熱射病急性肺組織損傷研究領(lǐng)域，初步探討了熱射病早期VEGF-A及相關(guān)細胞因子在肺組織內(nèi)的變化。但動物實驗并不能完全代替臨床實際情況，且VEGF-A及相關(guān)細胞因子變化與組織結(jié)構(gòu)、器官功能變化之間的關(guān)系尚須進行更深入的研究。

1 宋青．熱射病，致命的中暑［J］.軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2008，29（6）：453-454．

2 Leon LR， Helwig BG. Heat stroke： Role of the systemic inflammatory response［J］. J Appl Physiol， 2010， 109（6）： 1980-1988.

3 Kravchenko J， Abernethy AP， Fawzy M， et al. Minimization of heatwave morbidity and mortality［J］. Am J Prev Med， 2013， 44（3）：274-282.

4 Wu WS， Chou MT， Chao CM， et al. Melatonin reduces acute lung inflammation， edema， and hemorrhage in heatstroke rats［J］. Acta Pharmacol Sin， 2012， 33（6）： 775-782.

5 St?llberger C， Lutz W， Finsterer J. Heat-related side-effects of neurological and non-neurological medication may increase heatwave fatalities［J］. Eur J Neurol， 2009， 16（7）：879-882.

6 Chang CH， Kao CH， Chio CC， et al. Attenuating heatstroke-induced acute lung inflammation， edema， and injury in rats by exercise preconditioning［J］. J Trauma Acute Care Surg， 2013， 74（4）：1052-1059.

7 Yang HH， Hou CC， Lin MT， et al. Attenuating heat-induced acute lung inflammation and injury by dextromethorphan in rats［J］. Am J Respir Cell Mol Biol， 2012， 46（3）：407-413.

8 劉志鋒，唐柚青，徐秋林，等．熱打擊后小鼠肺和腦組織病理學(xué)的改變［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2011，20（6）：623-626．

9 高云，羅鳳鳴，范志航．血管內(nèi)皮生長因子與肺部疾病的關(guān)系［J］.中華哮喘雜志：電子版，2013，7（5）：369-374．

10 張婷，宋青，周飛虎，等．經(jīng)典型與勞力性熱射病動物模型之比較［J］.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，34（12）：1209-1212．

11 陳潔坤，宋青，李瑞生，等．肝素對勞力型熱射病大鼠模型早期干預(yù)的作用［J］.軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2014，35（5）：470-473.

12 Lord PF， Kapp DS， Hayes T， et al. Production of systemic hyperthermia in the rat［J］. Eur J Cancer Clin Oncol， 1984， 20（8）：1079-1085.

13 Bates DO. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability［J］. Cardiovasc Res， 2010， 87（2）：262-271.

14 Shibuya M. VEGF-VEGFR signals in health and disease［J］. Biomol Ther （Seoul）， 2014， 22（1）： 1-9.

15 Barratt S， Medford AR， Millar AB. Vascular endothelial growth factor in acute lung injury and acute respiratory distress syndrome［J］. Respiration， 2014， 87（4）：329-342.

16 Boussat S， Eddahibi S， Coste A， et al. Expression and regulation of vascular endothelial growth factor in human pulmonary epithelial cells［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2000， 279（2）：L371-L378.

17 唐弋均，王三亨．重癥肺炎患者血清腫瘤壞死因子α和白介素-10的變化及臨床意義［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2014，36（3）：396-397．

18 鐘梓文．急性肺損傷時白細胞介素10在肺泡巨噬細胞中的表達［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（9）：1555-1558．

19 Maitre B， Boussat S， Jean D， et al. Vascular endothelial growth factor synthesis in the acute phase of experimental and clinical lung injury［J］. Eur Respir J， 2001， 18（1）：100-106.

20 Pickkers P， Sprong T， Van Eijk L， et al. Vascular endothelial growth factor is increased during the first 48 hours of human septic shock and correlates with vascular permeability［J］. Shock， 2005， 24（6）：508-512.

21 Ito Y， Betsuyaku T， Nagai K， et al. Expression of pulmonary VEGF family declines with age and is further down-regulated in lipopolysaccharide （LPS）-induced lung injury［J］. Exp Gerontol，2005， 40（4）：315-323.

22 李晗， 姜肖剛， 謝瑋， 等. 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征患者呼出氣冷凝液血管內(nèi)皮生長因子A降低［J］ . 臨床檢驗雜志，2012， 30（4）： 315.

23 Thickett DR， Armstrong L， Millar AB. A role for vascular endothelial growth factor in acute and resolving lung injury［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2002， 166（10）：1332-1337.

24 Koh H， Tasaka S， Hasegawa N， et al. Vascular endothelial growth factor in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome［J］. Respirology， 2008， 13（2）： 281-284.

25 Leon LR， Dineen S， Blaha MD， et al. Attenuated thermoregulatory，metabolic， and liver acute phase protein response to heat stroke in TNF receptor knockout mice［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 2013， 305（12）： R1421-R1432.

Heat stress on vascular endothelial growth factor A in lungs of rats

YANG Wenchao1, GAO Tieying1, HU Jie1, LI Ruisheng2, ZHAO Jiajia1, ZHOU Jingjiang1, SONG Qing11Department of Critical Care Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Laboratory Animal Center, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

SONG Qing. Email: songqing3010301@sina.com

Objective To investigate the effect of heat stress on vascular endothelial growth factor A and related molecules in lungs of rats. Methods Thirty male SD rats were randomly divided into three groups: non-HS group (n=10), HS + 15-minute-recovery group (n=10) and HS + 3-hour-recovery group (n=10).Two heated groups of animals were put in a folded heating pad with general anesthesia. Once their core temperature (Tc) elevated to 42℃, the heated animals were allowed to recover at a room temperature for 15 min and 3 h. Levels of vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) and related molecules of the lung homogenate were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Results Compared with the non-HS group, the levels of VEGF-A and transforming growth factor beta1 (TGF-β1) increased significantly in the HS + 15-minute-recovery group, while decreased noticeably in the HS + 3-hour-recovery group. The level of pre-inf l amatory cytokine TNF-α slightly increased in the HS + 3-hour-recovery group. However, no signif i cant difference of the pre-inf l amatory cytokine IL-6 was found among the three groups. Conclusion The level of VEGF-A which may be only affected by heat injury in the early stage of heat stress decreases below the normal level after a transient elevation, and it plays a crucial role in the development of acute lung injury (ALI) in rats under heat stress.

heat stress; lung; vascular endothelial growth factor A

R 563

A

2095-5227(2015)02-0151-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.016

時間：2014-09-12 11:35

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140912.1135.005.html

2014-07-30

國家自然科學(xué)基金項目(81050005)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81050005)

楊文超，女，在讀碩士。研究方向：重癥醫(yī)學(xué)。Email: wenchao66397@163.com

宋青，女，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。Email: songqing301 0301@sina.com