瘦素在海人酸誘導小鼠顳葉癲癇海馬損傷中的作用

馮 杰，鄧子輝，張金英，薛 輝，梁 辰，李建華，顏光濤

解放軍總醫院，北京 1008531基礎所生化研究室；2生化科

瘦素在海人酸誘導小鼠顳葉癲癇海馬損傷中的作用

馮 杰1，鄧子輝1，張金英1，薛 輝1，梁 辰1，李建華1，顏光濤2

解放軍總醫院，北京 1008531基礎所生化研究室；2生化科

目的探討瘦素(Leptin)與顳葉癲癇發生、發展過程的關系。方法外源Leptin注射C57BL/6J小鼠后，右側海馬微量注射200 ng海人酸(kainic acid，KA)誘導顳葉癲癇，記錄小鼠癲癇評分，1周后觀察小鼠海馬病理變化，包括Western blot檢測Bax的表達水平，尼式染色(Nissl staining)觀察海馬Hilus區神經元丟失，免疫熒光檢測Hilus區星形膠質細胞活化與增殖。結果在200 ng KA誘導的顳葉癲癇模型基礎上，10 mg/kg外源Leptin預處理后，癲癇評分增加約52%，Bax表達水平升高約75%(P＜0.05)，海馬Hilus區神經元丟失嚴重，星形膠質細胞過度活化。結論Leptin增加了KA誘導的神經元凋亡，加重KA誘導的神經病理過程。

瘦素；海人酸；顳葉癲癇；星形膠質細胞；神經元；海馬Hilus

顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)占難治性癲癇60%以上，異常同步放電起源于顳葉，其中內側顳葉癲癇是顳葉癲癇的主要類型，內側顳葉癲癇的病灶位于顳葉內側結構，包括海馬、海馬旁回及杏仁核，是最常見的一種局部型癲癇綜合征[1]。顳葉癲癇主要的病理表現是海馬硬化和異常的海馬形態，并且常發生特征性的病理改變，包括神經元的丟失和星形膠質細胞活化。星形膠質細胞活化聚集形成瘢痕，神經元丟失最終導致海馬萎縮硬化[2]。顳葉癲癇的早期損傷主要包括海馬Hilus、CA1和CA3區神經元的丟失，導致異常的突觸間的連接，在外界刺激下神經元異常同步放電從而誘發癲癇。瘦素(Leptin)是由肥胖基因(obese gene，OB)編碼的16 kU的蛋白，包含167個氨基酸，血液中是去除21個氨基酸信號肽的多肽[3]。瘦素主要由脂肪細胞分泌的，具有調節能量代謝等生物學功能。研究發現，瘦素受體(ObR)在腦內很多部位表達[4]，包括下丘腦、海馬等，瘦素通過其受體可影響大腦神經元和膠質細胞凋亡或增殖。本研究探討瘦素和神經元丟失、星形膠質細胞活化的關系，從而認識瘦素對顳葉癲癇的病理發展的作用。

材料和方法

1材料 C57BL/6J小鼠(SPF級，60只)，8周齡，雄性，體質量20 ～ 22 g，購自解放軍總醫院醫學實驗動物中心；標準飼料(10% KJ%fat，北京中興飼料)；海人酸(kainic acid，KA)(Sigma Chemical Co. St Louis，MO，USA)；人重組Leptin(Peprotech公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris堿)(北京益利精細化學品公司)；腦立體定位儀(ZS-B/C，北京眾實迪創科技發展有限責任公司)；5μl微量進樣器Microliter Syringes(上海高鴿工貿有限公司)；乙醚(北京益利精細化學品公司)；甲苯胺藍(Sigma Chemical Co. St Louis，MO，USA)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Western Blot超敏發光液(北京普利萊基因技術公司)；一抗：Bax(Epitomics公司)，β-actin(Santa Cruz)膠質纖維酸性蛋白(GFAP，Cell Signaling Technology Inc. #3670)、瘦素受體(ObR，Santa Cruz Biotechnology)；二抗：山羊抗鼠Alexa Fluor(R)488，山羊抗兔Alexa Fluor(R) 555(1∶400，Cell Signaling Technology Inc.)、山羊抗兔IgG/辣根酶標記(北京中衫金橋公司)；Hochest33342(Sigma)；檸檬酸鹽緩沖液(北京普利萊基因技術公司)。

2顳葉癲癇小鼠模型的建立[5]將C57BL/6J小鼠分為0.9%氯化鈉注射組(對照組，10只)，Leptin注射組(Leptin，10只)，海人酸注射組(KA組，20只)，Leptin + KA注射組(LepKA組，20只)。將小鼠乙醚麻醉后，置于腦立體定位儀上，以大腦bregma為原點的海馬定位注射坐標：-2.0、-1.8、-2.3 (右側海馬)，進行單側注射海人酸200 ng(100 ng/ μl，2 μl)后，速度2 μl/5 min，注射結束留注射器5 min，縫合頭皮，碘伏消毒，放入籠中飼養1周。對照組以0.9%氯化鈉注射液代替海人酸，其余步驟和注射方式同海人酸；Leptin組以(10 mg/ kg)代替海人酸，其余步驟和注射方式同海人酸；LepKA組，在注射海人酸30 min前，小鼠腹腔注射Leptin(10 mg/kg)，然后進行右側海馬微量注射海人酸。

3行為學評分 0.9%氯化鈉注射液、Leptin、海人酸注射后4 h，根據Racine分級標準[6]進行癇性評分：0分：無驚厥；1分：咀嚼運動、眨眼、胡須顫抖等面部肌肉抽搐；2分：頸部肌肉抽搐，節律點頭；3分：單側前肢震顫，頸部肌肉痙攣；4分：雙前肢陣攣，后肢站立；5分：身體持續性強直，跌倒伴陣攣。記錄小鼠癲癇評分，作平均值。

4Western blot檢測Bax 小鼠處死后，取腦剝離右側海馬，放入RIPA蛋白裂解液，勻質離心提取總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白上樣量為50 μg，在質量分數為10%的SDS-PAGE上進行垂直電泳，然后電轉移到硝酸纖維素膜上(100 V，100 min)，將硝酸纖維素膜放入含5%脫脂奶粉(TBST溶解)塑料袋中，放入搖床37℃封閉1 h，將稀釋好的一抗，Bax(1∶1 000)、β-actin(1∶500)，4℃封閉過夜。取出后放室溫30 min，TBS/T漂洗膜3次× 10 min，加入稀釋好的二抗(1∶3 000)，37℃孵育30 min，TBS/T漂洗硝酸纖維素膜3次×10 min，加入發光液，暗室曝光。掃描后，使用Image Plus 6.0軟件，分析其灰度值，3次獨立實驗求平均值。

5尼式染色(Nissl staining) 4 μm石蠟切片脫蠟至水，用磷酸鹽緩沖溶液洗2 min，放1%甲苯胺藍溶液中室溫20 min，用梯度酒精依次脫水，結果尼式小體呈深藍色顆粒，細胞核呈淡藍色，背景基本無色。

6免疫熒光雙染法觀察ObR和GFAP共表達注射海人酸后的小鼠冠狀面石蠟切片(4 μm)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖溶液高壓修復5 min，5%山羊血清封閉，加入一抗瘦素受體(ObR)和膠質纖維酸性蛋白4℃過夜，漂洗后，加二抗Alexa Fluor (R) 488，Alexa Fluor (R) 555，37℃孵育40 min，Hochest 33342染核，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照，ObR顯紅色熒光，GFAP顯綠色熒光，細胞核顯淡藍色。

7免疫熒光法觀察海馬Hilus區GFAP的表達和形態變化 4 μm石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖溶液高壓修復5 min，5%的山羊血清封閉，GFAP(1∶400) 4℃過夜，漂洗后，山羊抗鼠Alexa Fluor (R)488二抗37℃孵育40 min，Hochest33342染核，置于顯微鏡下觀察并拍照，GFAP顯綠色，細胞核顯淡藍色。

8統計學方法 采用GraphPad Prism軟件進行統計分析，數據以表示，組間比較用t檢驗， P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1顳葉癲癇肥胖小鼠行為學評分 對照組和Leptin組小鼠行為評分為0，無癲癇樣發作，LepKA組Racine行為學評分為4.1分，顯著高于KA組2.7分，癲癇加約52%。見圖1。

2Leptin降低了顳小鼠海馬的抗凋亡能力對照組與Leptin組間Bax表達水平無差異，KA誘導模型后，Bax表達水平明顯增加(aP＜0.01)，在進行KA誘導前，外源給予Leptin預處理組(LepKA組)Bax表達水平相對于模型組升高了約75%(P＜0.01)。見圖2。

3光鏡下觀察神經元丟失情況 Leptin加重顳葉癲癇小鼠模型海馬Hilus區神經元丟失，小鼠冠狀面切片(4 μm)尼式染色顯示KA組海馬Hilus區神經元發生丟失，與KA組相比，Leptin預處理明顯加重海馬Hilus區神經元的丟失(LepKA組)，同時可觀察到Hilus區變得彌散。見圖3。

4KA處理后海馬Hilus區瘦素受體與星形膠質細胞共定位 激光共聚焦鏡下觀察模型組小鼠海馬免疫熒光染色顯示ObR與GFAP共定位，星形膠質細胞表達ObR，Leptin可通過ObR作用于星形膠質細胞，影響了星形膠質細胞的形態。見圖4。

5Leptin處理后星形膠質細胞變化 免疫熒光顯示，對照組與Leptin組間無差異，與KA組相比，Leptin預處加重了星形膠質細胞的活化和形態的改變，LepKA組中海馬Hilus區活化的星形膠質細胞變長加粗，Leptin預處理加重了顳葉癲癇的病理特征。見圖5。

圖 1 瘦素預處理后對海人酸誘導顳葉癲癇小鼠抽搐評分的影響(aP＜0.05, vs Saline組;bP＜0.05, vs KA組,每組n=8)Fig. 1 Effect of leptin pretreatment on seizure scores of mice after KA-induced TLE (aP＜0.05, vs Saline group, n=8;bP＜0.05, vs KA group, n=8)

圖 2 瘦素預處理后對海人酸誘導海馬凋亡蛋白Bax表達的影響(aP＜0.05, vs Saline組;bP＜0.05, vs KA組,每組n=4)Fig. 2 Effect of leptin pretreatment on KA-induced expression of hippocampal apoptosis protein Bax (aP＜0.05, vs Saline group, n=4;bP＜0.05, vs KA group, n=4)

圖 3 瘦素預處理后對海人酸誘導的海馬Hilus區神經元丟失的影響Fig. 3 Effect of leptin pretreatment on KA-induced neuron loss of hippocampal Hilus region

圖 4 瘦素受體和活化的星形膠質細胞共表達Fig. 4 Coexpression of ObRs and reactive astrocytes

圖 5 瘦素預處理后對海人酸誘導的海馬Hilus區星形膠質細胞活化的影響Fig. 5 Effect of leptin pretreatment on KA-induced astrocyte activation of hippocampal Hilus region

討 論

癲癇是神經系統中僅次于腦血管疾病的第二大病種，大部分可以用藥物控制，30%癲癇患者會發展為難治性癲癇，其中顳葉癲癇占很大部分。顳葉癲癇常見的病理學改變是海馬硬化、萎縮、海馬特定部位神經元丟失，膠質細胞增生[7]。苔蘚纖維出芽是人類顳葉癲癇的典型病理特征，苔蘚纖維是齒狀回顆粒細胞的軸突，正常情況下苔蘚纖維是同海馬Hilus區和CA3區錐體細胞的樹突建立聯系，在海人酸誘導損傷的情況下，Hilus區神經元和CA3區神經元顯著丟失，苔蘚纖維與靶細胞失去聯系，觸發苔蘚纖維異常出芽與自身胞體和樹突形成自身反饋的興奮性突觸，另外內分子層的傳入纖維起始于Hilus區神經元，Hilus區神經元的丟失使苔蘚狀纖維發芽構成新的傳入通路，形成異常的自反饋，在癲癇反復發作中起到重要作用[8-10]，海馬Hilus區在癲癇的發作中也起著重要作用。本研究采用海人酸誘導的顳葉癲癇小鼠模型，重點觀察小鼠海馬Hilus區的病理變化。

瘦素是一種主要由脂肪細胞分泌并釋放入血的多肽類激素，其可通過血腦屏障作用于中樞神經系統調節能量代謝[11]。近年絕大部分研究表明，瘦素具有減輕神經損傷的作用，如在腦缺血、阿爾茨海默病、帕金森病，谷氨酸誘導的癲癇中均有保護作用[12-14]。少量研究表明，高瘦素水平對癲癇的發生具有促進作用[15]，但是具體原因還不清楚。根據Lynch等[15]的研究，本文章探討腹腔注射(10mg/kg)瘦素在海人酸誘導的顳葉癲癇模型中的作用以及可能的潛在機制。

本研究觀察了Hilus區的神經元及星形膠質細胞在顳葉癲癇小鼠海馬損傷中的變化。在海人酸誘導顳葉癲癇基礎上，瘦素預處理后小鼠的癲癇行為評分增加，病理顯示海馬Hilus區神經元丟失加重，可能是由于小鼠海馬內凋亡蛋白Bax表達顯著升高，導致神經元抗凋亡能力下降。神經元和膠質細胞是人腦的主要構成組分，膠質細胞數量是神經元的5 ～ 10倍，其中數量最多的是星形膠質細胞，星形膠質細胞平鋪并緊緊包裹著神經元和血管，長期以來星形膠質細胞被認為主要對神經元起營養和支持作用，對維持神經元外的微環境起著至關作用[16]。星形膠質細胞的活化與病理刺激的嚴重程度相關，神經膠質酸性蛋白是星形膠質細胞的特異性標記物，在活化的星形膠質細胞中顯著增加，常用來鑒別大腦損傷區與非損傷區的星形膠質細胞[17]。在神經元丟失后，星形膠質細胞增殖活化既可以起到填充的作用，也可將損失部位隔離，但過度活化的星形膠質細胞形成的瘢痕、星形膠質細胞內谷氨酸合成酶含量降低也是癲癇反復發作及難以治愈的重要因素[18-19]。本研究發現，瘦素預處理后，顳葉癲癇小鼠海馬Hilus區GFAP表達增加，星形膠質細胞過度活化，呈現反應性星形膠質細胞形態主要表現為細胞增生和細胞形態發生改變，包括胞體肥大變粗、突起增加、延長、聚集成簇。外源性給予一定量的瘦素會加重海人酸誘導的病理損傷，其可能原因是降低神經元的抗凋亡能力，過度激活星形膠質細胞。瘦素可能作為研究顳葉癲癇的新的切入點。

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Role of leptin in kainic acid-induced hippocampal injury of temporal lobe epilepsy in mice

FENG Jie1, DENG Zihui1, ZHANG Jinying1, XUE Hui1, LIANG Chen1, LI Jianhua1, YAN Guangtao21

Research Laboratory of Biochemistry， Basic Medical Institute;2Department of Clinic Biochemistry Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

YAN Guangtao. Email: yan301@263.net

ObjectiveTo study the association of leptin with the occurrence and development of temporal lobe epilepsy.MethodsAfter injection of exogenous leptin, a normal dose of kainic acid (KA, 200 ng per mouse) were microinjected into the right hippocampus of C57BL/6J mice to induce temporal lobe epilepsy. Then, seizures were scored with the Racine scores，the hippocampal pathogenesis of mice on day 7 after the KA injection were observed, the expression level of Bax was measured by Western blot, the neuron loss of hippocampal Hilus was detected by Nissl staining, and the astrocyte activation and proliferation of hippocampal Hilus were tested by immunofluorescence method.ResultsCompared with KA-induced model, seizure scores increased by about 52%, the expression of Bax significantly increased by about 75%, the neuron loss significantly accelerated, and astrocyte was over activated in the KA-induced model combined with the exogenous leptin (10 mg/kg) pretreatment.ConclusionLeptin pretreatment aggravates the neuron apoptosis and pathogenesis induced by KA.

leptin; kainic acid; temporal lobe epilepsy; astrocyte; neurons; hippocampal Hilus

R 742.1

A

2095-5227(2015)04-0388-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.023

時間：2015-02-10 10:51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150210.1051.002.html

2014-11-17

科技基礎性工作專項項目(2011FY130100)；國家科技支撐計劃項目(2012BAK25B01)

Supported by the National Key Technology R&D Program(2012BAK25B01)

馮杰，男，2012級在讀碩士。研究方向：神經退行性疾病的機制。Email: fengjie654321@126.com

顏光濤，男，主任，研究員，博士生導師。Email: yan301 @263.net