雙特異性磷酸酶-1過表達對腎癌細胞株A498增殖和侵襲的影響

鞏會杰，牛少曦，李世超，沈東來，顧良友，李新濤，高 宇，張 瑜，馬 鑫，姚遠新，張 旭

解放軍總醫院 泌尿外科，北京 100853

雙特異性磷酸酶-1過表達對腎癌細胞株A498增殖和侵襲的影響

鞏會杰，牛少曦，李世超，沈東來，顧良友，李新濤，高 宇，張 瑜，馬 鑫，姚遠新，張 旭

解放軍總醫院 泌尿外科，北京 100853

目的構建攜帶人雙特異性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1，DUSP-1)基因的過表達慢病毒載體并包裝病毒，感染人腎癌細胞株A498后觀察DUSP-1的過表達對腎癌細胞株A498增殖和侵襲能力的影響。方法從pCMV6-XL5-DUSP-1質粒上獲得目的基因片段，采用DNA重組技術將DUSP-1基因插入到慢病毒表達載體質粒Plv-EGFP(2A)Puro中，獲得重組plv-EGFP(2A)Puro-DUSP-1載體。重組慢病毒表達質粒及輔助包裝質粒pH1、pH2共轉染293T細胞進行慢病毒包裝，收集病毒上清并感染腎癌細胞株A498，利用Western blot檢測細胞DUSP-1蛋白的表達情況。用MTS法檢測細胞增殖能力的變化，Transwell法檢測細胞侵襲能力的變化。結果成功構建攜帶DUSP-1過表達載體。包裝病毒后成功感染A498細胞株，DUSP-1蛋白表達較對照A498細胞株顯著上調。重組質粒組細胞在490 nm吸光值明顯上升(P＜0.05)；細胞侵襲試驗中，重組質粒組的穿膜細胞數明顯高于空載體組(P＜0.05)。結論成功構建了人DUSP-1基因的重組慢病毒表達載體pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1，進行病毒包裝后成功培養穩定高表達DUSP-1基因的腎癌細胞株；DUSP-1基因的過表達具有促進腎癌細胞株A498增殖和侵襲的作用。

雙特異性磷酸酶-1；腎癌細胞株A498；基因表達調控，腫瘤

雙特異性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1，DUSP-1)是由早期應答基因編碼的一種雙向特異性的蘇/酪氨酸磷酸酯酶，主要分布于細胞核內，在絲裂酶原蛋白活化激酶MAPK(細胞外信號調節激酶ERK，p38和c-jun氨基末端激酶JNK)的去磷酸化和失活方面發揮重要作用。MAPK信號傳導通路是與腫瘤發生、發展、侵襲、轉移及凋亡相關的重要信號傳導通路之一，DUSP-1能使活化的MAPK家族成員去磷酸化而失去活性，進而在腫瘤的發生、轉移及腫瘤細胞的凋亡等方面發揮重要作用[1-2]。本研究旨在構建帶有DUSP-1基因的重組慢病毒表達載體后進行病毒包裝，并通過感染A498篩選得到穩定高表達DUSP-1基因的腎癌細胞株，探討其對A498腎癌細胞增殖和侵襲能力的影響。

材料和方法

1材料 293T人腎小管上皮細胞、A498腎癌細胞株由本實驗室培養。胎牛血清FBS購自美國Gibco公司、DMEM高糖培養基、MEM/EBSS培養基購自美國Hyclone公司。6 cm和96孔細胞培養皿購自美國Corning公司。慢病毒包裝系統購自北京英茂盛業公司[含pLV-EGFP(2A)Puro表達載體、pH1和pH2輔助載體]。含人DUSP-1的CDS片段質粒pCMV6-XL5購自美國Origene公司。XbaⅠ限制性內切酶，BamHⅠ限制性內切酶、T4-DNA連接酶購自日本TAKARA公司。核酸染料Gelred購自美國Biotium公司，DNA凝膠回收試劑盒購自美國Promega公司，PCR Taq Master Mix、質粒小提試劑盒、DNA產物純化試劑盒購自北京天根公司，感受態細胞DH5α購自于北京全式金公司。脂質體Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，PCR引物合成、測序由Genewiz公司完成。DUSP-1抗體購自于美國MILLIPORE公司；羊抗兔、羊抗鼠抗體購自北京中杉金橋公司。MTS試劑購自美國Promega公司，Transwell小室、Matrigel基質膠購自美國BD公司。

2DUSP-1基因的擴增 從pCMV6-XL5-DUSP-1質粒上擴增DUSP-1基因，在引物上游和下游分別加入XbaⅠ和BamHⅠ黏性末端和保護堿基，引物序列為：上游5'-TGCTCTAGAATGGTCATGGAAGT GGGCA-3'；下游5'-CGCGGATCCTCAGCAGCTG GGAGAGGT-3'。PCR反應體系：模板1 μl、Taq Master Mix 10 μl、上下游引物共1 μl、ddH2O 8 μl。PCR擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸1 min共35個循環，72℃延伸10 min，回收反應產物。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，Gelred染色，利用凝膠成像觀察電泳結果。

3重組慢病毒質粒 pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1的構建、鑒定PCR獲得的DNA片段和載體同時酶切。酶切體系：20 μl×5：限制性內切酶XBaⅠ1 μl、限制性內切酶BamHⅠ1 μl、KBuffer 1 μl、質粒DNA 1.5 μl(530 ng/μl)/片段DNA 1 μl(780 ng/ μl)、分別加H2O至20 μl。37℃酶切4 h后行DNA電泳，進行目的片段膠回收。純化后測量濃度，將目的片段與載體連接。連接體系10 μl：T4 Ligase 1 μl、Buffer 1 μl、質粒DNA 5 μl(120 ng/ μl)/片段DNA 3 μl(68 ng/μl)。16℃連接過夜；將連接產物10 μl轉化入DH5α感受態細胞，接種于帶有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上培養12 ～ 14 h；挑克隆、搖床搖菌(37℃、200 r/min、14 ～ 16 h)；質粒提取；酶切鑒定(設置空載體對照)；將DNA電泳正確的質粒送測序。

4慢病毒包裝與感染 待293T細胞達70% ～ 80%融合時進行感染，分別將5 μg重組病毒載體、空載體與3.75 μg pH1質粒、1.25 μg pH2質粒按照Lipofectamine 2000說明書混合制成感染液，感染4 ～ 6 h后更換高糖培養基。48 h時收集細胞培養上清，10 000 r/min離心10 min，上清用0.45 μm的濾膜過濾后備用。將對數A498細胞接種于6 cm培養皿，待生長至融合度達70% ～ 80%時進行病毒感染，感染時加入1 ml病毒上清+ 3 μl Polybrene + 2 ml 10% FBS的EBSS培養基輕輕搖勻，24 h更換1次培養基，第5天在熒光顯微鏡下觀察熒光表達。

5Western blot檢測DUSP-1蛋白表達 收集感染的A498細胞，裂解后取40 μg左右處理后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，DUSP-1一抗1∶2 000稀釋后4℃孵育過夜，TBST洗膜3 min×5次，然后與山羊抗兔二抗1∶3 000，37℃孵育1 h，TBST洗膜3 min×5次，HRP-ECL法曝光，監測目的蛋白的表達。

6MTS法檢測A498細胞增殖 實驗設置重組質粒組和空質粒組，按照每孔5 000個細胞密度接種于96孔板中，在37℃、5% CO2培養24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加20 μl MTS試劑，繼續培養1 h后，用酶標儀測定490 nm波長各孔吸光值。每組設置3個復孔，重復3次。

7Transwell檢測細胞侵襲能力 用1% FBS培養基制備細胞懸液，調整細胞濃度為2×104/ml；向24孔板中加入500 μl含20% FBS的EBSS培養基；向每個小室中加100 μl制備的細胞懸液(于接種細胞前12 h在小室中鋪Matrigel基質凝膠)，溫箱中孵育24 h；用棉簽將小室上層未侵襲的細胞輕輕擦掉；將500 μl結晶紫染料加入24孔板未占用的孔中，將小室放入染料中，室溫避光染色20 min；將小室浸入盛有去離子水的燒杯中充分沖洗，用棉簽將小室上層未侵襲的細胞輕輕擦掉，超凈臺吹風干燥；顯微鏡下觀察照相，100倍鏡視野下隨機選取5個視野進行細胞計數。

8統計學方法 數據以表示，應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1PCR法獲取目的基因片段 取PCR產物5 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，顯示在約1 100 bp處有擴增條帶，片段與預期值一致，表明目的基因克隆成功(圖1)。

2重組慢病毒質粒的構建鑒定和測序 重組表達載體pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1經XBaⅠ、BamHⅠ雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳也顯示1 100 bp處的DUSP-1片段(圖2)。重組表達載體測序結果分析顯示，所插入的序列與理論序列完全一致，表明DUSP-1重組慢病毒表達質粒構建成功。

3慢病毒包裝結果 重組質粒與空質粒慢病毒感染A498細胞后第5天熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光表達情況(圖3)，感染效率為90%以上。Western blot法檢測DUSP-1蛋白表達，結果顯示，重組質粒組的DUSP-1表達顯著升高(圖4)。

4MTS法檢測A498細胞增殖 兩組細胞培養后，感染重組質粒組A498在鋪板后24 h、48 h、72 h、96 h的吸光值較空質粒組明顯增加，細胞增殖能力明顯增強(P＜0.05，圖5)。

5Transwell檢測細胞侵襲能力 重組質粒組穿膜細胞數為122±15，空質粒組穿膜細胞數為77±9。重組質粒組A498細胞的穿膜細胞數比空質粒組增加60%(P=0.01)，侵襲能力明顯增強(圖6)。

圖 1 DUSP-1基因的PCR擴增產物電泳圖M：200 bp標記物； 1 ～ 2： PCR擴增產物圖 2 重組慢病毒質粒酶切鑒定圖M：200 bp標記物； 1： 重組質粒； 2： 空質粒Fig. 1 Electrophoresis of DUSP-1 PCR productM: 200 bp Marker; 1-2: PCR productFig. 2 Enzyme cleave identification of the recombinant plasmidM: 200 bp Marker; 1: Recombinant plasmid; 2: Empty plasmid

圖 3 轉染后GFP表達情況(×100) A：空質粒組；B：重組質粒組Fig. 3 Expression of GFP after transfection (×100) A: Empty plasmid; B: Recombinant plasmid

圖 4 Western blotting檢測結果1： 轉染重組質粒組； 2： 轉染空質粒組Fig. 4 Western blotting result 1: Empty plasmid; 2: Recombinant plasmid

圖 5 重組質粒組的MTS于各個時間點在490 nm處光吸收值較空質粒組明顯增高(P＜0.05)Fig. 5 Absorbance of the recombinant plasmid group at different time points were significantly higher comparing with empty plasmid group (P＜0.05)

圖 6 A498細胞侵襲實驗 A： 空質粒組； B：重組質粒組Fig. 6 A498 cell invasion assay A: Empty plasmid; B: Recombinant plasmid (aP=0.01)

討 論

MAPK信號傳導通路是與腫瘤發生、發展、侵襲、轉移及凋亡相關的重要信號傳導通路之一，作為MAPKs內源性抑制劑的DUSP-1就成為了一個非常有潛在研究價值的調控因子。多數研究也表明，DUSP-1基因的異常表達與多種腫瘤的發生、發展、轉移、凋亡、抗藥性及缺氧誘導機制相關[3-5]。有研究表明，DUSP-1與非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)的血管生成、侵襲和轉移有關，敲低DUSP-1在NSCLC細胞中的表達可以提高腫瘤細胞對順鉑的敏感性[6-8]。DUSP-1在胰腺癌細胞中的高表達能促進體內的腫瘤形成，靶向作用于DUSP-1后，吉西他濱能更高效地誘導胰腺癌細胞的凋亡[9]。DUSP-1的表達與乳腺癌的進展呈正相關，是乳腺癌不良預后的獨立危險因素，同時也是是介導腫瘤化療抵抗的重要因素[10-11]。這些都說明，DUSP-1在腫瘤的發生、發展中作為促癌基因發揮作用。然而在前列腺癌的研究中，DUSP-1的表達水平隨著腫瘤分期的升高而降低，過表達DUSP-1后能促進前列腺癌細胞DU145的凋亡[12]。在子宮內膜癌中，DUSP-1的表達下降可作為腫瘤進展以及發生惡性轉移的潛在標記物[13]。腎透明細胞癌惡性程度高，對放療、化療均不敏感，與腫瘤進展相關的功能機制研究尚未有明確結果[14-17]。有研究描述腎透明細胞癌中抑制DUSP-1的表達可以增加JKN相關的細胞凋亡[18]。基于此我們設計了實驗，研究過表達DUSP-1在腎癌細胞系中的作用。

本實驗以慢病毒載體pLV-EGFP(2A)Puro為基礎，成功構建含有人DUSP-1基因的重組慢病毒質粒pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1，經過包裝得到病毒顆粒并感染人腎癌細胞株A498，獲得了可穩定高表達DUSP-1的A498-DUSP-1細胞。本實驗構建的A498-DUSP-1細胞增殖速度明顯提高，細胞的侵襲能力顯著增強，初步說明DUSP-1在腎癌的發展及轉移過程中有促進腫瘤生長、增強腫瘤侵襲力的作用。

本實驗為后期DUSP-1基因在腎癌細胞生物學功能研究及動物模型的建立奠定了一定的實驗基礎。對腎透明細胞癌DUSP-1信號通路的研究，有助于進一步闡明腎透明細胞癌的發生、發展機制，為腎癌的治療及預后評估提供新的思路。

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Effect of DUSP-1 overexpression on proliferation and invasion of renal cell carcinoma cell line A 498

GONG Huijie, NIU Shaoxi, LI Shichao, SHEN Donglai, GU Liangyou, LI Xintao, GAO Yu, ZHANG Yu, MA Xin, YAO Yuanxin, ZHANG Xu

Department of Urology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

ZHANG Xu. Email: xzhang@foxmail.com

ObjectiveTo construct the pLV-EGFP (2A) Puro-DUSP-1 lentiviral expression vector and package virus and observe the effect of DUSP-1 overexpression on proliferation and invasion of human renal cell carcinoma cell line A498.MethodsThe target gene obtained from pCMV6-XL5-DUSP-1 was cloned into Plv-EGFP (2A) Puro vector by recombinant DNA technology. The recombinant lentiviral vector pLV-EGFP (2A) Puro-DUSP-1 was co-transfected into 293T cells with packaging plasmids pH1 and pH2 to package virus. The A498 cell line was infected by virus supernatant, and then western blot was used to detect the expression of DUSP-1 protein. The effects of DUSP-1 on proliferation and invasion of A498 cells were analyzed using MTS and Transwell method.ResultsAfter successful construction of the recombinant pLV-EGFP (2A) Puro-DUSP-1 lentiviral expression vector, packaging of lentiviral particles and transfection of A498 cell line, the expression of DUSP-1 was significantly upregulated in protein level compared with the empty vector group. MTS assay showed that the absorbance in the recombinant vector group was significantly increased after transfection (P＜0.05) and transwell assay showed that cell invasion numbers in the recombinant vector group were also increased compared with the empty vector group (P＜0.05).ConclusionRecombinant pLV-EGFP (2A) Puro-DUSP-1 lentiviral expression vector is successfully constructed and the lentiviral particles are successfully packaged. The overexpression of DUSP-1 can significantly increase cell proliferation and invasion of A498 cell line.

dual specificity phosphatase 1; renal carcinoma cell line A498; gene expression regulation, neoplastic

R 737.11

A

2095-5227(2015)04-0379-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.021

時間：2014-12-29 10:53

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141229.1053.001.html

2014-10-17

基金課題：國家高技術研究發展計劃(863)資助課題(2012AA021100)

Supported by the National High Technology Research and Development Program of China ("863" Program)(2012AA021100)

鞏會杰，男，在讀碩士。Email: urologhj@qq.com

張旭，男。Email: xzhang@foxmail.com