兩種卵巢切除術式建立大鼠骨質疏松模型的優勢比較

李 明，呂厚辰，尹鵬濱，李瑞生，張里程，唐佩福，張立海

1解放軍總醫院 骨科，北京 100853；2解放軍第302醫院 動物實驗中心，北京 100039

兩種卵巢切除術式建立大鼠骨質疏松模型的優勢比較

李 明1，呂厚辰1，尹鵬濱1，李瑞生2，張里程1，唐佩福1，張立海1

1解放軍總醫院 骨科，北京 100853；2解放軍第302醫院 動物實驗中心，北京 100039

目的對比兩種卵巢切除術式建立大鼠骨質疏松模型的便捷性及安全性。方法40只3月齡雌性SD大鼠隨機均分為2組，背側部雙切口手術組(OVX 1，n=20)、腹部正中切口手術組(OVX 2，n=20)分別進行相對應卵巢切除術，對比兩種術式手術用時、出血量、術后并發癥及骨密度(bone mineral density，BMD)情況。結果OVX 1組與OVX 2組手術平均時間分別為(26.35±7.55) min和(30.95±6.39) min，OVX 1組較OVX 2組手術時間短(P＜0.05)。OVX 1組與OVX 2組平均出血量分別為(1.81±0.81) g和(1.82±0.77) g，差異無統計學意義(P＞0.05)。OVX 1組與OVX 2組術者操作成長曲線(大鼠數量-手術時間，大鼠數量-手術出血量)均呈現負性相關(r=-0.846 8，P=0.000，r=-0.788 2，P=0.000；r=-0.903 4，P=0.000，r=-0.891 2，P=0.000)。OVX 2組1例術后切口開裂感染，兩組大鼠均未出現死亡情況，OVX 1組術前與術后3個月第5腰椎平均骨密度分別為(0.376±0.021) g/cm2和(0.264±0.026) g/cm2，OVX 2組為(0.371±0.016) g/cm2和(0.275±0.019) g/cm2，BMD均明顯降低(P＜0.05)。3個月后兩組大鼠剖腹探查發現，OVX 1組無腹腔粘連，OVX 2組腹腔粘連嚴重。結論背側部雙切口卵巢切除術建立大鼠骨質疏松模型操作更為簡便、手術用時少、安全性高。

動物模型；大鼠；骨質疏松；卵巢切除術

目前，去卵巢手術建立大鼠絕經后骨質疏松模型是骨質疏松基礎研究經常采用的方法[1]。由于大鼠在雌激素缺乏后骨代謝變化情況與人相似，因此其在骨質疏松病因學、病理生理學、診斷學、治療藥物藥代動力學及預防學等方面具有較高的研究價值[2-4]。大鼠絕經后骨質疏松模型常用的建立方法為卵巢切除術，手術方式主要有背側部雙切口與腹部正中切口兩種。在既往研究中兩種術式都有較為廣泛的應用，但是在手術操作的便捷性、安全性及建模效果方面孰優孰劣并無系統報道[5-6]。故本文在前期開展大鼠骨質疏松相關研究的基礎上，對比了背側部雙切口與腹部正中切口兩種術式，并詳細介紹了大鼠去卵巢建立骨質疏松模型的操作步驟，歸納了術后特殊注意事項，為進行相關建模工作的同行提供參考。

材料和方法

1實驗動物 3月齡健康雌性SD大鼠40只，體質量(265±30)g，由解放軍第302醫院動物實驗中心提供。大鼠分籠飼養于室溫24℃，日照12 h，相對濕度45% ～ 55%，通風良好的環境中，飼喂大鼠專用飼料，由解放軍第302醫院動物實驗中心提供，自由飲水，適應環境2周后開始實驗。采用單純隨機對照實驗方法，將40只大鼠按體質量大小編號，進行完全隨機分組，將40只大鼠隨機平均分為OVX 1及OVX 2組。

2藥品與器械 麻醉藥物(1%戊巴比妥鈉)，碘伏，75%酒精，青霉素G 5×106IU/瓶，新潔爾滅，100 ml 0.9%氯化鈉注射液。手術刀，手術剪，眼科剪，手術鑷，組織鉗，止血鉗，縫合針，醫用慕斯線3-0/T，紗布，棉球。

3背側部雙切口入路去卵巢手術 大鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉溶液(45 mg/kg)麻醉。取俯臥位固定，于背部后正中線旁開1.5 cm，雙側肋緣下1.5 cm處為中心，半徑為1.5 cm備皮，分別用碘伏和酒精于術部消毒(圖1A)，覆蓋無菌鋪單，以背部后正中線旁開1.5 cm，雙側肋緣下1 cm為切口，向下切開皮膚1 ～1.5 cm，鈍性分離皮下組織，切開肌層，暴露腹腔，切口視野可見白色脂肪，撥開脂肪，可見脂肪包裹呈粉紅色桑葚狀的卵巢(圖1B)，輕柔分離卵巢下輸卵管與脂肪，用組織鉗夾閉卵巢下輸卵管，將輸卵管用慕斯線結扎，剪除卵巢(圖1C)，將斷端輸卵管送回腹腔，間斷縫合肌層、皮膚，用碘伏再次消毒皮膚縫合口(圖1D)。同法切除另一側卵巢。術后于大鼠大腿肌肉內注射青霉素G鈉鹽40 000 IU。

4腹部正中切口入路去卵巢手術 大鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉溶液(45 mg/kg)麻醉。取仰臥位固定，于腹正中線距離陰道口2.5 cm處為中心，半徑1.5 cm備皮，分別用碘伏和酒精于術部消毒，覆蓋無菌鋪單(圖2A)，以腹正中線距陰道口3.5 cm處為切口，向下切開皮膚1.5 ～ 2 cm，鈍性分離皮下組織，切開肌層、腹膜，打開腹腔，切口視野可見白色脂肪，撥開脂肪層找到子宮，沿著輸卵管輕柔拉出，其末端可見脂肪包裹呈粉紅色桑葚狀的卵巢(圖2B)，輕柔分離卵巢下輸卵管與脂肪，用組織鉗夾閉卵巢下輸卵管，將輸卵管用慕斯線結扎，剪除卵巢(圖2C)，將斷端輸卵管送回腹腔，行腹腔、肌層全層間斷縫合，間斷縫合皮膚，用碘伏再次消毒皮膚縫合口(圖2D)。同法去除另一側卵巢。術后于大鼠大腿肌肉內注射青霉素G鈉鹽40 000 IU。

圖 1 背側部雙切口入路去卵巢手術 A： OVX 1配皮消毒區域； B： 暴露桑葚狀卵巢； C： 結扎近端輸卵管； D： 消毒縫皮Fig. 1 Double dorsal-lateral incision of ovariectomyA: OVX 1 disinfection area of skin; B: exposed ovaries; C: proximal tubal ligation; D: disinfection and sewing leather

圖 2 腹部正中切口入路去卵巢手術 A： OVX 2配皮消毒區域； B： 暴露桑葚狀卵巢； C： 結扎近端輸卵管； D： 消毒縫皮Fig. 2 Midline abdominal incision of ovariectomyA: OVX 2 disinfection area of skin; B: exposed ovaries; C: proximal tubal ligation; D: disinfection and sewing leather

5術后處理 手術完成后將動物置于電暖氣旁蘇醒，待動物蘇醒后放入單籠飼養，籠內鋪放無菌墊料，視墊料污染情況及時更換，術后連續3 d密切觀察皮膚切口、精神狀態及進食進水情況。于術后1 d開始每天注射青霉素G鈉鹽40 000 IU，共3 d。

6統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行分析，計量數據以表示，行定量數據t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1兩組大鼠體質量變化 OVX 1與OVX 2術后3 d，大鼠精神狀態良好，期間自由覓食、飲水,各項活動正常,未出現死亡。術前及術后3個月兩組大鼠體質量均明顯增加(P＜0.01)，兩組術前及術后3個月體質量無統計學差異(表1)。

2手術時間 手術時間以皮膚切開起始，雙側皮膚縫合完畢為止，背側部雙切口比腹部正中切口用時短(P=0.044 3，P＜0.05)。OVX 1、OVX 2后5只平均手術時間較前5只明顯縮短(P=0.000 1，P＜0.05)，OVX 1后5只平均手術時間較OVX 2用時短(P=0.022 1，P＜0.05)(表2)。OVX 1與OVX 2術者操作成長曲線(大鼠數量-手術時間)呈現負相關。(OVX 1組r=-0.846 8，P=0.000；OVX 2組r=-0.903 4，P=0.000)(圖3)。

3手術出血量 手術出血量以紗布術后與術前重量差值為標準(單位g)，兩組手術方式出血量差異無統計學意義(P=0.968 3，P＞0.05)。OVX 1、OVX 2后5只手術出血量較前5只明顯減少(P=0.000 1，P＞0.01)(表3)。OVX 1與OVX 2術者操作成長曲線(大鼠數量-手術出血量)均呈負相關(OVX 1組r=-0.788 2，P=0.000；OVX 2組r=-0.891 2，P=0.000)(圖4)。

4術后并發癥 OVX 1術后1周未出現切口感染，OVX 2術后1只出現切口開裂、紅腫、膿性分泌物感染跡象，予以單籠飼養，抗生素抗感染治療后康復。

5骨密度(bone mineral density，BMD)結果 選擇雙能X線吸收法(DXA)測定骨密度儀(美國Hologic公司)，進行活體大鼠骨密度掃描掃，分別于實驗開始時(12周齡)、術后3個月(24周齡)進行掃描。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠呈俯臥位平置在掃描臺上，四肢盡量外展，尾部彎曲后置，利用自帶的小動物骨密度分析軟件分析測定骨密度。每次掃描前均使用由同一廠家提供體模進行質量控制性掃描。OVX 1術前與術后3個月第5腰椎平均BMD均明顯降低(P＜0.05)，兩種術式3個月后BMD差異無統計學意義(P＞0.05)(表4)。

6大鼠腹腔粘連情況 術后3個月兩組大鼠開腹探查發現，OVX 1腹腔情況正常。OVX 2腹腔出現明顯粘連，內臟排列較OVX 1組紊亂。

表1 兩組大鼠體質量變化情況Tab. 1 Changes of body weight of rats in two groups (g,±s)

表1 兩組大鼠體質量變化情況Tab. 1 Changes of body weight of rats in two groups (g,±s)

Group (n=20)Weight of preoperative Weight of postoperative after 3 monthsP OVX 1288.50±17.49363.88±23.560.000 0 OVX 2282.38±9.87365.75±24.260.000 0 P 0.402 80.877 6

表2 兩組大鼠手術時間Tab. 2 Operation time of two groups (min,±s)

表2 兩組大鼠手術時間Tab. 2 Operation time of two groups (min,±s)

(n=20)Operation timeOperation time of top five ratsOperation time of last five ratsP OVX 126.35±7.5536.60±4.3919.60±3.210.000 0 OVX 230.95±6.3939.40±4.0424.60±2.300.000 0 P0.044 30.753 80.000 0 Group

表3 兩組大鼠手術出血量Tab. 3 Blood loss of two groups (g,±s)

表3 兩組大鼠手術出血量Tab. 3 Blood loss of two groups (g,±s)

Group (n=20)Blood lossBlood loss of top five ratsBlood loss of last five ratsP OVX 11.81±0.812.86±0.541.12±0.180.000 0 OVX 21.82±0.772.82±0.571.02±0.280.000 0 P0.968 30.821 00.187 1

表4 兩組大鼠BMD改變Tab. 4 BMD of two groups (g/cm2)

圖 3 大鼠數量-手術時間變化曲線 (OVX 1組 r = -0.846 8， P=0.000；OVX 2組 r = -0.903 4， P=0.000)Fig. 3 Curves of quantity of rats-operation time change (OVX 1 group: r = -0.846 8， P=0.000； OVX 2 group: r = -0.903 4，P=0.000)

圖 4 大鼠數量-手術出血量變化曲線 (OVX 1組： r = -0.788 2， P=0.000；OVX 2組： r = -0.8912， P=0.000)Fig. 4 Curves of quantity of rats-blood loss change (OVX 1 group: r = -0.788 2， P=0.000； OVX 2 group: r = -0.8912， P=0.000)

討 論

建立骨質疏松動物模型在研究骨質疏松發病機制、探討防治措施和新藥研究中占有十分重要的地位。目前獲得骨質疏松模型有很多方法，包括低鈣飲食、糖皮質激素誘導、制動、去勢等方法[7]。自1969年Savile建立絕經后大鼠動物模型以來，去勢方法一直被認為是最可靠的建模手段，并且去卵巢大鼠是FDA和WHO推薦的研究絕經后骨質疏松癥的經典模型[8]。當前研究多使用3 ～ 10月齡未孕雌鼠且造模持續時間多為12 ～ 24周以建成絕經后骨質疏松模型[9-14]。Jast和Jasiuk[15]用高分辨率micro-CT掃描儀，對3周、12周、32周、42周、60周、72周雌性SD大鼠股骨皮質骨三維結構掃描后發現，隨周齡增加，大鼠脛骨骨微結構的變化并不明顯，提示3月齡大鼠股骨的骨微結構已發育成熟穩定，不再隨發育而發生顯著變化，已適合建立去卵巢骨質疏松大鼠模型，故本實驗采用3月齡未孕雌性SD大鼠建模。有研究發現，12周齡大鼠分別在去卵巢后6周和8周時股骨骨密度均顯著降低，分別降低了26.3%和28.0%[16]。Cao等[17]通過去勢法建立大鼠骨質疏松建模，術后12周發現第4腰椎與股骨BMD較假手術組分別減少了23.9%和25.6%。余萍萍等[18]發現大鼠行卵巢切除術后3個月腰椎BMD較假手術組降低了12.6%。王翔等[19]發現3月齡大鼠卵巢切除術后3個月腰椎BMD較對照組降低了18.7%。同樣，Wang等[20]發現3月齡SD雌鼠行去勢建模術后3個月大鼠第4 ～ 6腰椎平均BMD較假手術組降低了約20%。本實驗選擇建模持續時間為12周，經DXA測定建模前后腰椎BMD的改變[21]，結果顯示，兩組BMD均明顯降低，OVX 1與OVX 2組第5腰椎BMD分別減少了29.7%和25.9%，降低幅度＞20%，確定此次建模成功。

經過對比，背側部手術較腹正中切口手術方式用時短，結合大鼠的生理解剖，原因為背側部切開后直接暴露卵巢，減少手術探查尋找時間。OVX 1與OVX 2前5只手術時間無差異，可能與術者手術操作生疏有關，隨著術者手術技術嫻熟，OVX 1后5只手術時間較OVX 2明顯縮短。此外，背側部與腹部正中手術方式出血量無差異，原因為大鼠卵巢切除術出血主要發生于剝離卵巢與周圍脂肪，皮膚與肌肉切口出血量很少，所以兩種術式出血量無明顯差異。腹部正中切口有1例出現切口裂口、感染，考慮有以下3點因素：1)縫合不牢，切口開裂，導致感染；2)大鼠腹部與飼養籠底摩擦，縫合線斷裂，導致感染；3)大鼠腹部與飼養籠底摩擦，接觸自身排泄物，導致感染以致切口開裂。OVX 1與OVX 2術后均未出現休克及死亡情況，原因為術中輸卵管結扎牢固，卵巢切除后周圍脂肪按壓止血，確保無顯性出血后，將斷端送回腹腔。大鼠術后置于電暖氣旁復溫，待其麻醉蘇醒后置單籠飼養。兩種術式隨著手術數量的增加，術者手術技術的提高，在手術時間、出血量方面均有下降的趨勢。3個月后兩組行剖腹探查發現，OVX 1組無粘連，OVX 2組粘連嚴重，原因為切口入路不同，導致上述情況，腹腔粘連可能會干擾后續腹腔內注射藥物及藥物吸收情況，故建模后續研究如需腹腔給藥，建議行OVX 1術式，降低腹腔粘連對藥物吸收干擾。

綜上，背側部雙切口卵巢切除術的操作更為簡便、手術用時少、安全性高，術中減少輸卵管牽拉，不會改變腹腔正常解剖結構，降低術后腹膜粘連機會。嫻熟的手術操作及術后精心護理對減少手術時間，降低術后并發癥也有著重要的影響。

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Comparison of advantages of two kinds of ovarian resection in establishing osteoporosis model in rats

LI Ming1, LYU Houchen1, YIN Pengbin1, LI Ruisheng2, ZHANG Licheng1, TANG Peifu1, ZHANG Lihai1

1Department of Orthopaedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Center of Animal Experiment, Chinese PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China

ZHANG Lihai. Email: zhanglihai74@qq.com

ObjectiveTo compare the simplicity and safety of two operative methods in inducing osteoporosis in rats.MethodsForty 3-month old female SD rats were divided into two groups randomly: OVX 1 group (n=20) and OVX 2 group (n=20). In the first group, ovariectomy was a double dorsal-lateral incision. In the second group, ovariectomy was a midline abdominal incision. Surgical operation time, blood loss, postoperative complications and BMD were compared between two groups.ResultsThe average operation time of OVX 1 group was significantly shorter than that of OVX 2 group (26.35±7.55 min vs 30.95±6.39 min, P＜0.05). The average blood loss of OVX 1 group and OVX 2 group was 1.81±0.81 g and 1.82±0.77 g, respectively, with no significant difference (P＞0.05). The level of surgery time and blood loss were negative correlated with the number of rats in OVX 1 and OVX 2 group (r=-0.846 8, P=0.000, r=-0.788 2, P=0.000; r=-0.903 4, P=0.000, r=-0.891 2, P=0.000). One case in OVX 2 group had complication of incision infection. No rats died in two groups. All rats had undergone Dual X-ray Absorptiometry (DXA) Measurement before and three months after operation. The bone mineral density (BMD) of the fifth lumbar was 0.376±0.021 g/cm2before operation and 0.264±0.026 g/cm2three months after operation in OVX 1 group, and 0.371±0.016 g/cm2and 0.275±0.019 g/ cm2in OVX 2 group, which were significantly reduced (P＜0.05). Rats in OVX 2 group had severe abdominal cavity adhesion after three month.ConclusionThe double dorsal-lateral incision of ovariectomization is technically easier, less time consuming and more safety in establishing the rat model of osteoporosis.

animal model; rats; osteoporosis; ovariectomy

R 681.4

A

2095-5227(2015)04-0383-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.022

時間：2015-02-04 10:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150204.1048.002.html

2014-10-31

國家自然科學基金面上項目(31370947)；國家自然科學基金青年科學基金項目(8140090663)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31370947); National Natural Science Foundation for Youth of China(8140090663)

李明，男，在讀碩士。Email: liming891215@163.com

張立海，男，博士，副主任醫師，副教授，碩士生導師。

Email: zhanglihai74@qq.com