125例成人急性髓系白血病免疫表型特點分析

王會芳，蘇顯都，于彩霞，王家坡，王國增，王麗麗，張 碩，李麗霞，李 健

1河北省涿州市醫院 檢驗科，河北涿州 072750；2海南省農墾那大醫院 檢驗科，海南那大 571700；3解放軍總醫院 檢驗科，北京 100853

125例成人急性髓系白血病免疫表型特點分析

王會芳1，蘇顯都2，于彩霞1，王家坡1，王國增1，王麗麗1，張 碩1，李麗霞1，李 健3

1河北省涿州市醫院 檢驗科，河北涿州 072750；2海南省農墾那大醫院 檢驗科，海南那大 571700；3解放軍總醫院 檢驗科，北京 100853

目的探討成人急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)患者的免疫表型特點及臨床意義。方法2011年5月- 2014年6月在河北省涿州市醫院和解放軍總醫院就診的125例成人AML患者為研究對象，采用多色流式細胞術，以CD45/SSC雙參數散點圖設門，對其骨髓進行免疫表型檢測。結果AML患者髓系特異性抗原表達陽性率依次為CD13(90.4%)、CD33(86.4%)、MPO(80.0%)、CD117(73.6%)；CD14和CD15主要在M4和M5中表達，CD64和CD15同時強陽性伴HLA-DR高表達，提示M5可能性大；在M3患者中有較強的自發熒光，表達髓系抗原CD13、CD33和MPO，低表達CD34和HLA-DR。造血干/祖細胞標記抗原CD34、HLA-DR、CD38在AML中呈高表達，分別為53.6%、70.4%、71.2%。125例中56例伴有淋系抗原表達，各抗原表達率依次為CD56(25.6%)、CD7(19.2%)、CD19(9.6%)、CD4(7.2%)、CD2(6.4%)。有淋系抗原表達(LymAg+)組表達CD34+比例和肝脾大患者比例明顯高于無淋系抗原表達(LymAg-)組(P＜0.01)。伴有CD7+患者完全緩解(CR)率明顯低于CD7-患者(P＜0.05)，而伴有淋系抗原表達的AML患者CR率(55.6%)與未伴有淋系抗原表達的AML患者CR率(76.2%)差異無統計學意義(P＞0.05)。結論AML患者高表達CD13、CD33、MPO，部分患者同時表達髓系、淋系抗原；伴有CD7+表達的患者，化療后CR率低，預后較差。

急性髓系白血病；流式細胞術；免疫表型

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液系統惡性疾病，骨髓被髓系白血病細胞代替，失去分化成熟潛力。AML的法美英(FAB)分型存在著個人主觀因素、細胞形態的多樣性等局限性。隨著流式細胞術(flow cytometry，FCM)的廣泛應用，免疫學分型對白血病分型的診斷尤為重要[1-4]。它可以全面、特異、準確地檢測出白血病細胞抗原的分布情況，對白血病的診斷、治療及預后分析具有重要意義。本研究對125例初診成人急性髓系白血病患者應用多色流式細胞術CD45/ SSC雙參數散點圖設門方法進行免疫表型分析，探討各種類型AML表型分化抗原的表達特點及意義。

對象和方法

1研究對象 2011年5月- 2014年6月于河北省涿州市醫院和解放軍總醫院就診的125例初診成人AML患者，骨髓經瑞氏-吉姆薩染色及各種組化染色，分子生物學、免疫學、遺傳學檢測最終確診為AML。診斷標準參照天津標準和FAB標準，其中男性67例，女性58例，中位年齡40.2(26 ～82)歲。按FAB分類M112例、M247例、M325例、M414例、M518例、M64例、M75例。125例均行骨髓穿刺(bone marrow aspiration，BMA)及流式細胞術檢測。

2主要儀器和試劑 流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司的FACSCalibur。所用單克隆抗體包括多甲藻葉綠素蛋白標記的CD45、異硫氰酸熒光素、別藻青蛋白或

藻紅蛋白標記CD34、CD10、CD19、CD9、CD2、CD14、CD13、HLA-DR、CD33、CD7、CD3、CD38、CD117、CD64、CD56、CD15、CD20、髓過氧化物酶、CD22、CD4、CD41及同型對照IgG等，以上試劑均購自美國Becton Dickinson公司。

3方法 根據AML患者中各抗原表達情況分組，其中有淋系抗原表達(LymAg+)56例，無淋系抗原表達(LymAg-)69例；并分析抗原CD7+和CD7-組，LymAg+和LymAg-組，CD34+和CD34-組，CD56+和CD56-組，CD19+和CD19-組與AML患者完全緩解率的關系。采用四色直接免疫熒光法和骨髓涂片檢查，分析AML患者細胞形態及免疫表型特點。

4流式細胞分析 取肝素抗凝骨髓標本3 ml，24 h內上機檢測。將每個試管中加入肝素抗凝骨髓或外周血(1×106/ml)100μl及四色直接標記熒光抗體，室溫避光孵育20 min，再向各試管中加入溶血素500μl，震蕩置室溫避光，10 min后用500μl PBS洗滌細胞1次，加入500μl PBS重懸細胞。測定前以標準校正熒光微球校正儀器，用流式細胞儀Cell Quest軟件獲取并分析50 000個細胞，對數取樣，CD45/SSC設門選中幼稚細胞群體，再對幼稚細胞群體進行分析，檢測各種抗原的表達率。陽性判斷標準：抗原CD3/MPO/CD34≥10%，其他抗原≥20%。

5統計學處理 實驗數據采用SPSS17.0統計軟件處理，正態分布資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗或Mann-Whitney檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1CD45/SSC設門的FCM檢測結果 125例成人AML患者免疫表型(圖1)證實白血病細胞比例為50.7% ～ 92.8%，與骨髓形態學(圖2)檢查結果(53.2% ～ 96.4%)基本一致，在允許誤差范圍內(＜5%)。

圖 1 1例AML患者骨髓細胞 CD45/SSC 散點圖Fig. 1 Scatter plot of BM cells CD45 in a AML patient P1: group of blast cells; P2: lymphocytes; P3: monocytes; P4: neutrophils)

圖 2 AML患者骨髓細胞形態Fig. 2 BM cell morphology of AML patients

2AML患者的造血干/祖細胞標記抗原及髓系抗原表達 造血干/祖細胞標記抗原CD34、HLADR、CD38在AML中呈高表達，分別為53.6%、70.4%、71.2%；但M3中CD34、HLA-DR表達明顯低于其他亞型(P＜0.05)。在25例M3中CD9、CD13、CD33、CD117、CD64和MPO表達均明顯高于CD34和HLA-DR(P＜0.05)。125例中主要表達髓系抗原CD13、CD33、MPO和CD117，分別為90.4%、86.4%、80.0%和73.6%。CD14和CD15主要在M4和M5中表達；CD64主要在M5、M3、M4、M2中表達，分別為72.2%、68.0%、57.1%、46.8%；CD64和CD15同時陽性表達多見于M4和M5。CD41在7例M7中有5例表達，而在M1～ M6中未見表達。見表1。

3AML患者淋系抗原表達 125例中56例伴有淋系抗原表達，陽性率為44.8%；以CD56表達最高占25.6%，其次為CD7(19.2%)、CD19(9.6%)、CD4(7.2%)、CD2(6.4%)，CD3、CD20、CD22無表達。除M3和M7外，其他AML亞型中均可見CD7不同程度表達。CD56在AML各亞型中均有表達，多見于M1和M5。另外2個淋系相關抗原共表達也可見，CD7+和CD56+共表達者6例，CD19+和CD56+共表達者3例，CD7+和CD4+共表達者2例、CD56+和CD4+共表達者2例。見表2。

4AML患者LymAg+組和LymAg-組臨床特征比較

根據淋系抗原(LymAg)表達情況，將125例成人AML患者分為LymAg+組(56例)和LymAg-組(69例)。LymAg+組表達CD34+比例和肝脾大患者比例明顯高于LymAg-組(P＜0.01)；而兩組間平均年齡、性別、血紅蛋白水平、白細胞數、血小板數、骨髓原始細胞百分比及抗原CD38+比較均無統計學差異(P＞0.05)。見表3。

5免疫表型與預后的關系 125例中90例接受治療，有13例放棄治療。20例對癥支持治療延緩生命，2例臨床死亡(均為M3患者)。CD7+組CR率(38.1%)明顯低于CD7-組(84.1%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。盡管LymAg+、CD34+、CD56+、CD19+組CR率均低于其對應的陰性組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4。

表1 AML患者造血干/祖細胞標記抗原及髓系抗原表達Tab. 1 Hematopoietic stem / progenitor cells labeled antigen and myeloid antigen expression in AML patients

表2 AML患者淋系抗原表達Tab. 2 Lymphoid antigen expression in AML patients

表3 LymAg+組和LymAg-組臨床特征比較Tab.3 Comparison of clinical features in LymAg+group and LymAg-group

表4 免疫表型與完全緩解率的關系Tab.4 Relationship between immunophenotype and complete remission

討 論

隨著單克隆抗體及流式細胞儀的應用，免疫分型在急性白血病的診斷、治療和預后中具有重要的作用。根據FAB標準，以細胞形態學和細胞化學染色為依據，其診斷準確率僅為60% ～ 80%[5-7]，而免疫分型診斷準確率可達90%左右。另外，免疫分型可以反映FAB分型無法顯示的一些生物學特性，如雙表型及急性淋巴細胞白血病的分期等，這些都與治療方案制訂和預后判斷有關。我們采用CD45/SSC設門法，來區別正常細胞和白血病細胞，并根據CD45表達的水平來鑒別白血病細胞的異質性。

通過分析125例成人AML患者免疫表型結果顯示，主要表達髓系抗原CD13、CD33、MPO、CD117，其中最常見的抗原表達是CD13和CD33，因此CD13和CD33對判斷白血病細胞是否為髓系來源時具有很高的診斷價值。M3患者的免疫表型有一定特性，CD13、CD33、MPO高表達，CD34、HLA-DR很少表達，與文獻報道基本一致[8-10]。另外，CD9在M3患者中呈高表達，陽性率為72.0%，以上分型特點在M3與其他亞型AML的鑒別診斷中具有很好提示作用。CD34是一個階段特異而非系特異的抗原，反映細胞的分化處于較早期階段。CD14作為單核細胞的特異標記，敏感性較差，在M4和M5中常缺乏表達或弱表達。本研究中CD14在M4和M5的陽性率僅為28.6%、33.3%，這可能是由于CD14主要表達于成熟單核細胞、弱表達于幼單核細胞，而原始單核細胞表面很少表達，因此對其診斷應結合其他單克隆抗體、細胞化學染色、遺傳學和分子生物學綜合分析。M5主要表達CD64、CD15和HLA-DR，陽性率分別為72.2%、88.9%、94.4%，與文獻報道相似[11]。這表明CD64和CD15同時強陽性伴HLA-DR高表達提示M5可能性大。CD117主要表達于正常的造血干細胞或髓系干祖細胞。有研究顯示，CD117在AML患者中的表達明顯高于ALL患者，其髓系特異性好于CD13、CD33[12]。本研究中73.6%的AML患者表達CD117，主要是M1(91.7%)、M2(85.1%)和M5(72.2%)，與國內報道相似[13]。對于M3患者CD117的表達，目前尚存不同觀點，本研究中M3高表達CD117(80.0%)，與Zheng等[14]報道的結果基本一致。在7例M7患者中有5例表達CD41，陽性率為71.4%，但CD41除表達于巨核細胞外，也能跟血小板結合，另外，血小板極易和白血病細胞黏附，造成假陽性。因此M7免疫分型特征有待進一步研究。

關于AML患者淋系抗原表達情況，發現56例AML細胞表面有淋系抗原的表達，陽性率為44.8%，其中以CD56、CD7較常見。CD7抗原并非T淋巴細胞的特異性標記抗原，多能干細胞、髓系干細胞與微分化型AML細胞等均可表達CD7抗原。本研究中，CD7的陽性率為19.2%，主要表達于M1，其次是M5、M4、M2，與文獻報道基本一致[15-16]。CD7+表達的AML患者CR率明顯低于CD7-表達的患者(P＜0.05)。這提示CD7+表達的AML患者預后較差。CD56主要在自然殺傷(natural killer，NK)細胞和部分T細胞表面上表達，是NK細胞特異性分化抗原，與細胞黏附有一定關系。有文獻報道15% ～ 35%的AML患者可表達CD56[17]，主要在M1、M2、M5中表達。本研究中CD56的陽性率為25.6%，在M5中表達最高，其次是M1和M2，多伴CD13、CD33、CD34和HLA-DR表達。這提示CD56+的AML是一種分化程度較差的白血病。盡管CD56+的AML患者CR率低于CD56-，但兩者差異無統計學意義(P＞0.05)，與文獻報道不一致[18]，這可能與各研究的病例數或所使用的單克隆抗體來源不同有關。CD19是B系淋巴細胞的特異性分化抗原，但有研究發現在AML中也有異常表達。本研究中AML患者表達CD19的陽性率為9.6%，盡管CD19+的AML患者CR率低于CD19-，但兩者差異無統計學意義(P＞0.05)。另外，LymAg+組表達CD34+比例和肝脾大患者比例明顯高于LymAg-組(P＜0.01)，而其他臨床特征在兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)。淋系分化抗原表達在AML患者中的預后意義存在不同觀點，這可能與方法學、研究的樣本量以及治療方案等的差異有關。

總之，FCM免疫分型可以分析白血病細胞的來源和所處的分化階段，提高急性白血病分型的準確性，更好地指導治療及判定預后。

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Acute myeloid leukemia by flow cytometry immune phenotypic: A characteristics analysis of 125 cases

WANG Huifang1, SU Xiandu2, YU Caixia1, WANG Jiapo1, WANG Guozeng1, WANG Lili1, ZHANG Shuo1, LI Lixia1, LI Jian3

1Department of Clinical Laboratory, Zhuozhou City Hospital, Zhuozhou 072750, Hebei Province, China;2Department of Clinical Laboratory, Nongken Nada Hospital, Nada 571700, Hainan Province, China;3Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

LI Jian. Email: hemthm@yahoo.com

ObjectiveTo investigate immune phenotypic characteristics of adult patients with acute myelogenous leukemia (AML) and its clinical significance.MethodsOne hundred and twenty-five adult patients with AML admitted to Zhuozhou City Hospital and Chinese PLA General Hospital from May 2011 to June 2014 were enrolled in this study. The immune phenotype in the 125 cases with AML were detected by multicolor flow cytometry with CD45 / SSC double parameters scatter plot setting as door.ResultsThe positive rate of myeloid specific antigen expression in AML patients were CD13 (90.4%), CD33 (86.4%), MPO (80.0%), CD117 (73.6%). CD14 and CD15 mainly expressed in M4and M5. CD64 and CD15 also showed strongly positive with high expression of HLA-DR which suggested high possibility of M5. A strong autofluorescence, myeloid antigens CD13, CD33 and low expression of CD34, MPO and HLA-DR were shown in M3patients. Hematopoietic stem/progenitor cell marker antigen CD34, HLA-DR and CD38 were highly expressed in AML with the rate of 53.6%, 70.4% and 71.2%. Of the 125 cases, 56 cases showed leaching antigen expression with the expression rate of CD56 (25.6%), CD7 (19.2%), CD19 (9.6%), CD4 (7.2%), CD2 (6.4%), respectively. The expression of CD34+ratio and the proportion of hepatosplenomegaly patients in LymAg+group were significantly higher than LymAg-group (P＜0.05). And the complete remission (CR) rate in patients with CD7+was significantly lower than CD7-patients (P＜0.05). However, there showed no significant difference in the CR rate of AML patients with lymphoid antigen expression and AML patients without lymphoid antigen expression (55.6% vs. 76.2%, P＞0.05).ConclusionAML patients show high expression of CD13, CD33, MPO, and part of AML patients also show expression of myeloid and lymphoid antigen. Patients with CD7+expression have low CR ratio with poor prognosis.

acute myeloid leukemia; flow cytometry; immunophenotype

R 733.3

A

2095-5227(2015)04-0363-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.04.017

時間：2015-02-10 10:41

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150210.1041.001.html

2014-11-24

保定市科技支撐項目(14ZF010)

Supported by the Key Technology R＆D Program of Hebei Province(14ZF010)

王會芳，女，主管檢驗師，副主任。研究方向：臨床檢驗診斷。Email: fangzeyu2006@163.com

李健，男，博士，主任醫師，副主任。Email: hemthm@yahoo.com