血紅素加氧酶-l在大鼠肝硬化性腎損傷中的保護作用

唐惠子，張一兵，王 婧，徐 冰

1遼寧醫學院，遼寧錦州 121000；2遼寧醫學院附屬第三醫院，遼寧錦州 121000

血紅素加氧酶-l在大鼠肝硬化性腎損傷中的保護作用

唐惠子1，張一兵2，王 婧1，徐 冰1

1遼寧醫學院，遼寧錦州 121000；2遼寧醫學院附屬第三醫院，遼寧錦州 121000

目的探討改變肝硬化大鼠腎中血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)表達水平對腎的保護作用和可能的作用機制。方法將32只雄性SD大鼠隨機分為4組：假手術組、肝硬化組、氯高鐵血紅素組和鋅原卟啉組。膽總管結扎建立大鼠肝硬化模型，氯高鐵血紅素組膽總管結扎5周后隔日腹腔注射氯高鐵血紅素(30 μmol/kg)，鋅原卟啉組膽總管結扎5周后隔日腹腔注射鋅原卟啉(10 μmol/kg)。4周后檢測腎的各項生化指標，觀察各組腎形態學改變，檢測腎中HO-1的含量。結果肝硬化組血肌酐(serum creatinine，Scr)、胱抑素-C (cystatin C，Cys-C)、肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)水平分別為(44.52±3.31)μmol/L、(0.75±0.04) mg/L、(2.40±0.37) ml/min；氯高鐵血紅素組Scr、Cys-C、Ccr水平分別為(36.96±1.68)μmol/L、(0.50±0.03) mg/L、(3.40±0.62) ml/min；鋅原卟啉組Scr、Cys-C、Ccr水平分別為(72.18±3.86)μmol/L、(0.91±0.05) mg/L、(1.03±0.30) ml/min。氯高鐵血紅素組Scr、Cys-C水平較肝硬化組明顯降低(均P＜0.01)，而Ccr明顯升高(P＜0.01)。鋅原卟啉組Scr、Cys-C水平較肝硬化組明顯升高(均P＜0.01)，而Ccr明顯降低(P＜0.01)。且氯高鐵血紅素組腎組織病理明顯改善。結論腹腔注射氯高鐵血紅素提高肝硬化大鼠腎中HO-1表達水平可以減輕腎損傷程度。

血紅素加氧酶-1；肝硬化；腎損傷

進展期肝病和重癥肝硬化患者合并腎損傷很常見，相關研究報道在醫院就診的肝硬化患者中合并腎損傷的概率是20%[1]。肝硬化合并腎損傷是重癥肝硬化患者死亡的主要原因之一，肝硬化后機體發生了一系列病理變化，全身和腎的血流動力學改變，隨著肝硬化的病程加深，腎血管收縮逐漸加劇，腎血管阻力增加，導致腎血流量減少，病情進展迅速[2-3]。研究表明，HO-1可以抑制內源性縮血管系統活性，但目前關于HO-1在肝硬化性腎損傷的研究主要集中于HO-1在腎組織中的表達水平[4-6]。本實驗通過藥物干預改變肝硬化大鼠腎中HO-1的表達水平，從而探討HO-1對肝硬化大鼠腎的影響。

材料和方法

1 實驗動物 采用健康清潔級6周齡雄性SD大鼠32只，體質量200 ～ 250 g，實驗動物質量合格證明號：SCXK(遼)2010-0001(由遼寧長生生物技術有限公司提供)。

2 試劑與儀器 氯高鐵血紅素(51280-1G)、鋅原卟啉(282820-50MG)(美國Sigma生物技術有限公司)；HO-1兔多克隆抗體(BA0605-1)，免疫組化試劑盒，DAB顯色劑，防脫載玻片(武漢博士德生物技術有限公司)；7600全自動生化分析儀(美國Beckman)，小型臺式離心機(美國Sigma公司)，顯微鏡(CX21型，日本OLYMPUS)，電鏡(遼寧醫學院電鏡室提供)，電子天平(上海方瑞儀器廠)。3 肝硬化大鼠模型的制備和分組 將32只雄性SD大鼠隨機分成4組(每組8只)：1)假手術組：分離膽總管不結扎；2)肝硬化組：分離膽總管并結扎；3)氯高鐵血紅素組：分離膽總管并結扎，5周后隔日腹腔注射氯高鐵血紅素(30 μmol/kg)誘導腎中HO-1生成，連續4周；4)鋅原卟啉組：分離膽總管并結扎，5周后隔日腹腔注射鋅原卟啉(10 μmol/kg)抑制腎中HO-1生成，連續4周。

4 標本采集與檢測 大鼠腹腔給藥4周后，處死前收集24 h尿液檢測尿肌酐(urinary creatinine，Ucr)。各組大鼠麻醉后心臟取血，7600全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)，血肌酐(serum creatinine，Scr)，尿肌酐，血胱抑素-C (cystatin C，Cys-C)各項生化指標，計算肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)。

5 腎HE染色 取左側部分腎組織用0.9%氯化鈉注射液沖洗后，固定于10%甲醛中24 h，經石蠟包埋后切成3μm厚的切片，進行HE、免疫組織化學染色。

6 電鏡觀察腎超微結構 將腎組織修剪成1 mm× 1 mm×1 mm的組織塊，2%戊二醛，1%鋨酸固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋。光鏡下做超薄切片，鈾鉛雙染，用于電鏡觀察。

7 免疫組織化學檢測腎組織HO-1 采用SABC方法，60℃溫箱烤片30 min，切片脫蠟至水，3% H2O2室溫10 min滅活內源性酶，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復抗原2 min，滴加5% BSA封閉液，37℃30 min，滴加適當稀釋的一抗(1∶100)，濕盒4℃過夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃30 min。滴加試劑SABC，37℃ 30 min。DAB顯色，鏡下控制反應時間，蘇木素復染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗染色作空白對照。棕黃色為陽性染色，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，以陽性染色的積分光密度(IOD)值來表示HO-1的含量，每張切片隨機選5個200倍視野。

8 Western blot檢測腎中HO-1表達 裂解液提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉膜于硝酸纖維素膜，抗兔HO-1 (1∶300)孵育，二抗孵育顯影。

9 統計學處理 實驗數據使用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 各組大鼠生化指標 4組大鼠ALT、Scr、Cys-C、Ucr、Ccr的總體均值均不全相同(F值分別是319.63、251.315、436.21、26.94、33.63，P=0.00)。與假手術組相比，肝硬化組ALT、Scr、Cys-C明顯升高(t值分別為20.69、7.02、27.50，P＜0.01)，Ucr、Ccr明顯降低(t值分別為-6.14、-5.59，P＜0.01)。與肝硬化組相比，氯高鐵血紅素組ALT、Scr、Cys-C明顯降低(t值分別為7.76、5.04、11.89，P＜0.01)，Ucr明顯增高(t=-3.92，P＜0.01)，Ccr增高(t=-3.60，P＜0.05)。與肝硬化組比較，鋅原卟啉組ALT、 Scr、 Cys-C明顯增高(t值分別為-11.90、-13.92、 -6.39，P＜0.01)，Ccr明顯降低(t=7.18，P＜0.01)，Ucr降低(t=2.48，P＜0.05)。見表1。

2 肝組織病理形態學觀察 光鏡下，假手術組大鼠肝結構正常，肝細胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列。肝硬化組大鼠肝結構紊亂，門管區有大量以淋巴細胞為主的炎細胞浸潤，并伴有肝纖維組織增生，肝細胞再生及假小葉形成。見圖1。

表1 各組大鼠ALT、Scr、Ucr、Ccr、Cys-C比較Tab. 1 Level of ALT, Scr, Ucr, Ccr, Cys-C in different groups ()

表1 各組大鼠ALT、Scr、Ucr、Ccr、Cys-C比較Tab. 1 Level of ALT, Scr, Ucr, Ccr, Cys-C in different groups ()

aP＜0.01, vs sham group;bP＜0.01, vs hepatic cirrhosis group;cP＜0.01, vs hemin group

3 腎組織病理形態學及超微結構觀察 光鏡下，可觀察到假手術組腎無顯著變化，腎小管與腎小球結構完整，腎小管上皮排列整齊，腎結構基本正常。肝硬化組大鼠可見腎小管上皮細胞脫落、變性，并可見蛋白管型。氯高鐵血紅素組可見部分腎小管上皮細胞濁腫，腎小管上皮細胞刷狀緣丟失，鋅原卟啉組可見腎小管上皮細胞變性壞死、脫落，時可見部分壞死灶。電鏡下，可以觀察到假手術組腎無顯著變化。氯高鐵血紅素組腎小管上皮細胞質內有空泡形成，線粒體腫脹。肝硬化和鋅原卟啉組細胞質內有空泡形成，線粒體腫脹并且有空泡形成，基底膜增厚，足細胞融合。見圖2、圖3、圖4。

4 免疫組織化學檢測腎HO-1表達 腎中HO-1表達于腎小管內皮。與假手術組相比，肝硬化組腎HO-1表達陽性的腎小管減少(t=-27.27，P＜0.01)。與肝硬化組相比，氯高鐵血紅素組HO-1累積光密度(integral optical density，IOD)值顯著升高(t=-13.33，P＜0.01)，鋅原卟啉組腎組織HO-1 IOD值明顯降低(t=17.15，P＜0.01)，很難發現腎小管HO-1陽性。見圖5，表2。

5 Western blot檢測腎中HO-1含量 與假手術組相比，肝硬化組腎HO-1含量減少。與肝硬化相比，氯高鐵血紅素組腎HO-1含量顯著增高，鋅原卟啉組腎HO-1幾乎沒有表達。見圖6、圖7。

表2 各組大鼠腎組織HO-1的IOD值Tab. 2 IOD of HO-1 in renal tissue ()

表2 各組大鼠腎組織HO-1的IOD值Tab. 2 IOD of HO-1 in renal tissue ()

aP＜0.01, vs sham group;bP＜0.01, vs hepatic cirrhosis group;cP＜0.01, vs hemin group

圖 1 肝HE染色(×40) A：假手術組； B：肝硬化組Fig. 1 Hepatic HE staining (×40) A: Sham group; B: Hepatic cirrhosis group

圖 2 腎HE染色(×200) A：假手術組； B：肝硬化組； C：氯高鐵血紅素； D：鋅原卟啉Fig. 2 Renal HE staining (×200) A: Sham group; B: Hepatic cirrhosis group; C: Hemin group; D: Znpp group

圖 3 腎小管電鏡觀察(×10 000) A：假手術組； B：肝硬化組； C：氯高鐵血紅素； D：鋅原卟啉Fig. 3 Renal tubules electron microscope (× 10 000) A: Sham group; B: Hepatic cirrhosis group; C: Hemin group; D: Znpp group

圖 4 腎小球電鏡觀察(×5 000) A：假手術組； B：肝硬化組； C：氯高鐵血紅素；D：鋅原卟啉Fig. 4 Glomerular electron microscopy (×5 000) A: Sham group; B: Hepatic cirrhosis group; C: Hemin group; D: Znpp group

圖 5 腎小管免疫組化染色(×200) A：假手術組； B：肝硬化組；C：氯高鐵血紅素； D：鋅原卟啉Fig. 5 Renal tubular immunohistochemical staining (×200) A: Sham group; B: Hepatic cirrhosis group; C: Hemin group; D: Znpp group

圖 6 各組大鼠腎組織HO-1蛋白表達強度 A：假手術組； B：肝硬化組； C：氯高鐵血紅素； D：鋅原卟啉Fig. 6 HO-1 protein expression in renal tissue A: Sham group; B: Hepatic cirrhosis group; C: Hemin group; D: Znpp group

圖 7 各組大鼠腎HO-1 IOD/β-action比較 A：假手術組； B：肝硬化組； C：氯高鐵血紅素； D：鋅原卟啉Fig. 7 Comparison of renal HO-1 IOD/β-action A: Sham group; B: Hepatic cirrhosis group; C: Hemin group; D: Znpp group

討論

HO-1是一種氧化還原酶，為血紅素代謝的起始酶和限速酶[7]。其在血管生物學、細胞氧化應激和疾病預防等方面發揮重要作用。HO-1在生理條件下低水平表達，其活性可因血紅素、活性氧、細胞因子等刺激而提高約100倍[8]。

本實驗通過藥物干預改變肝硬化大鼠腎中HO-1的表達水平，氯高鐵血紅素組膽總管結扎5周后隔日腹腔注射氯高鐵血紅素(30 μmol/kg)來誘導HO-1的生成，鋅原卟啉組膽總管結扎5周后隔日按10μmol/kg腹腔注射鋅原卟啉抑制HO-1的生成，免疫組化結果證實氯高鐵血紅素組腎中HO-1表達含量顯著高于鋅原卟啉組。本實驗數據顯示，與肝硬化組相比，氯高鐵血紅素組Ccr明顯增高，而鋅原卟啉組Ccr明顯減低。光鏡下可見氯高鐵血紅素組大鼠腎部分腎小管上皮細胞濁腫，刷狀緣丟失。電鏡下可見腎小管上皮細胞質內有空泡形成，線粒體腫脹。而鋅原卟啉組大鼠腎損傷程度明顯加重，光鏡下可見腎小管上皮細胞變性壞死、脫落，甚至可見部分壞死灶。電鏡下可見細胞質內有空泡形成，線粒體腫脹并且有空泡形成，基底膜增厚，足細胞融合。實驗結果證實了氯高鐵血紅素組腎損傷程度較鋅原卟啉組明顯減輕，肝硬化大鼠腎中HO-1的表達水平與腎損傷程度呈負相關。相關研究表明，HO-1的細胞保護作用是建立在其催化產物所具有的抗氧化、抗炎、抗凋亡等活性的基礎上[9-10]。HO-1與血紅素1∶1結合，生成等摩爾的游離鐵、CO和膽紅素[11]。過去一直認為膽紅素為有害的代謝產物，Stocker等首次提出生理濃度的膽紅素是強效的內源性抗氧化物，能有效地清除過氧化基團和抑制脂質過氧化，發揮抗氧化及細胞保護作用[12]。CO系統在調整血管緊張度方面起著很重要的作用[13-14]。CO激活血管平滑肌細胞的可溶性鳥苷酸環化酶，使細胞內環磷酸鳥苷酸濃度升高，引起血管平滑肌舒張，增加腎血流和腎小球濾過率[7,15-16]。此外，CO與細胞色素P450結合減少其產物二十烷酸等縮血管物質的生成，也是腎血流灌注增加的原因之一[17-18]。

總之，本研究提示HO-1可以減輕大鼠膽汁性肝硬化性腎的損傷程度，改善腎功能。因此，HO-1可能為臨床治療和預防肝硬化性腎損傷提供一個新的思路和藥物靶點。

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Protective effects of heme oxygenase-l on renal damage due to hepatic cirrhosis

TANG Huizi1, ZHANG Yibing2, WANG Jing1, XU bing1
1Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China;2The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

ZHANG Yibing. Email: zyb38555@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of heme oxygenase-l (HO-1) on renal damage due to hepatic cirrhosis and explore the possible mechanism.MethodsThirty-two male SD rats were randomly divided into four groups including sham group, hepatic cirrhosis group, Hemin group and Znpp group. Hepatic cirrhosis models of rats were established by common bile duct ligation, and then after 5 weeks, rats in the Hemin and Znpp groups received intraperitoneal injection of Hemin (30 μmol /kg) and Znpp (10 μmol /kg) on alternate days, respectively. The biochemical indexes of kidney, the renal morphology changes and the content of HO-1 protein in each group were observed and tested.ResultsThe levels of Scr, Cys-C, Ccr were (44.52±3.31) μmol/L, (0.75±0.04) mg/L, (2.40±0.37) ml/min in hepatic cirrhosis group and (36.96±1.68) μmol/L, (0.50±0.03) mg/L, (3.40±0.62) ml/min in Hemin group and (72.18±3.86) μmol/L, (0.91±0.05) mg/L, (1.03±0.30) ml/min in Znpp group, respectively. The levels of Scr, Cys-C were signifcantly lower in Hemin group than in hepatic cirrhosis group and higher in Znpp group than in hepatic cirrhosis group (P＜0.01), and the level of Ccr was signifcantly higher in Hemin group than in hepatic cirrhosis group and lower in Znpp group than in hepatic cirrhosis group (P＜0.01). The renal pathological lesions were signifcantly improved in Hemin group.ConclusionIntraperitoneal injection of Hemin can improve the renal HO-1 protein expression in rats with liver cirrhosis, thus relieving the degree of kidney damage.

heme oxygenase -1; liver cirrhosis; renal injury

R-332

A

2095-5227(2015)01-0079-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.01.025

時間：2014-10-13 10:04

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141013.1004.001.html

2014-07-22

遼寧醫學院校長基金-奧鴻博澤研究生科研創新基金資助(2013010)

唐惠子，女，在讀碩士。研究方向：臨床檢驗診斷學。Email: 849293501@ qq.com

張一兵，男，教授，碩士生導師。Email: zyb38555@163. com