正加速度暴露對實驗性胃潰瘍大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達和胃黏膜血流量的影響

趙 錕，陳 英，李 靜，范 勤，唐合蘭，楊春敏，王建昌

空軍總醫院，北京 1001421干部病房消化科；2麻醉科；3醫院辦公室

基礎研究論著

正加速度暴露對實驗性胃潰瘍大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達和胃黏膜血流量的影響

趙 錕1，陳 英1，李 靜1，范 勤2，唐合蘭1，楊春敏1，王建昌3

空軍總醫院，北京 1001421干部病房消化科；2麻醉科；3醫院辦公室

目的研究正加速度(positive acceleration，+Gz)暴露對實驗性胃潰瘍大鼠胃黏膜降鈣素基因相關肽mRNA(calcitonin gene-related peptide-mRNA，CGRP-mRNA)的表達及胃黏膜血流(gastric mucosal blood flow，GMBF)的影響。方法選擇雄性SD大鼠40只隨機分成4組，每組10只，A組為正常對照組，不做處理；對B、C、D組大鼠采用乙酸燒灼法建立胃潰瘍模型，造模3 d后加速度處理大鼠，B組地面捆綁5 min(相當于+1 Gz恒速暴露)，C組+5 Gz旋轉5 min，D組+10 Gz旋轉5 min，隔日1次，共4次。1周后麻醉大鼠并固定，用MoorVMS-LDF2型激光多譜勒血流儀測定GMBF；采集胃黏膜組織，用熒光定量PCR的方法定量測定胃黏膜CGRP-mRNA含量(2-△△ct)。結果胃黏膜CGRP-mRNA的含量，B組(3.090±0.154)較A組(0.966±0.089)升高(P＜0.05)；+Gz暴露后，B組＞C組(2.262±0.116)＞D組(1.096±0.077)，差異均有統計學意義(P＜0.05)。GMBF量，A組(432.919±11.598) pU＞B組(367.602±10.133) pU＞C組(303.925±16.417) pU＞D組(246.750±22.815) pU，差異均有統計學意義(P＜0.05)。胃潰瘍大鼠(B組、C組、D組大鼠)+Gz暴露后，CGRP-mRNA表達和GMBF量存在正相關(r=0.807，P＜0.05)。結論+Gz暴露導致實驗性大鼠胃潰瘍愈延遲合，其可能與+Gz條件下胃黏膜血流量減少及胃黏膜CGRP-mRNA的表達改變有關。

正加速度；胃潰瘍；胃黏膜血流；降鈣素基因相關肽mRNA

隨著高性能戰斗機和航天載人宇宙飛船的應用，航空航天環境給飛行員帶來了嚴峻的挑戰。據報道，消化系統疾病占飛行員內科疾病的6.6%，位居飛行員內科疾病的前3位[1]。+Gz暴露后飛行員消化性疾病的高發病率和高復發率引起了航天航空醫學界的重視，相關研究逐漸增多，也取得了一定的進展。已有研究報道，+Gz暴露會加重胃黏膜損傷、延遲潰瘍愈合、降低潰瘍的愈合質量，考慮可能與+Gz作用下一些胃腸激素、細胞因子、胃黏膜血供等改變有關。但目前相關機制研究尚未深入到mRNA表達水平，亦沒有同步測定胃黏膜血流(gastric mucosal blood flow，GMBF)變化的報道[2-3]。因此，我們制備大鼠胃潰瘍模型，觀察不同+Gz條件下胃黏膜降鈣素基因相關肽mRNA(calcitonin gene-related peptide-mRNA，CGRP-mRNA)的表達和GMBF的變化情況，并探討+Gz暴露對潰瘍愈合影響的相關機制，為飛行員的胃腸防護提供依據。

材料和方法

1 實驗動物 40只雄性SD大鼠，清潔SPF級，體質量(200g±10) g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)-2012-0004，空調下飼養，溫度(20±2)℃，濕度50% ～ 60%，每12 h明暗交替光照，食用軍事醫學科學院實驗動物中心提供的全營養顆粒飼料，自由飲食。

2 試劑與儀器 小動物離心機(由航天航空醫學研究所提供)，英國MoorVMS-LDF2型激光多普勒血流儀(由北京吉安得爾公司提供)，Real-Time PCR儀(美國ABI 7500)，計算機圖像分析儀(Image-Pro Plus Analysis Soft ware)，Trizol試劑盒(購自Invitrogen公司)，M-MLV反轉錄試劑盒(購自Takara公司)，Real-time PCR擴增試劑盒(購自北京中原領先科技有限公司)，無菌動物手術器械及縫合線等(由航天航空醫學研究所提供)，硫噴妥鈉(Sigma公司)，慶大霉素(廣州白云山天心制藥股份有限公司)，100%乙酸(國藥集團化學試劑有限公司)，碘伏消毒液(北京四環衛生藥械有限公司)。

3 動物分組 40只雄性SD大鼠隨機分成4組，每組10只，A組為正常對照組，B組為模型+1 Gz組，C組為模型+5 Gz組，D組為模型+10 Gz組。

4 胃潰瘍模型制備 采用經典的Okabe方法(即乙酸燒灼致胃潰瘍模型的方法)[4]。根據本實驗條件略作調整：大鼠適應性飼養3 d，造模前禁食不禁水24 h，稱體質量，以3%硫噴妥鈉按1.5 ml/kg腹腔注射麻醉，于劍突下沿腹正中線打開腹腔，手術切口1.5 ～ 2.0 cm，暴露出胃，用浸有100%乙酸直徑為0.5 cm的圓形濾紙片貼于胃竇小彎處(避開血管)2次，每次30 s，1 min后迅速吸去殘存的乙酸，用5號線將大網膜覆蓋乙酸燒灼處縫合于胃壁上，輕輕還納胃，用0.9%氯化鈉溶液沖洗腹腔，吸凈后注入0.5 ml慶大霉素以預防感染和粘連，最后縫合腹壁，消毒。將大鼠放回鼠籠。手術后注意觀察大鼠飲食、活動、皮毛色澤及手術切口愈合情況。

5 +Gz暴露 采用動物離心機模擬+Gz暴露，利用特制的固定盒承載大鼠，大鼠頭朝向離心機軸心，俯面固定于離心機轉臂遠端。采用梯形+Gz作用曲線，G值增長率1 G/s(由計算機進行加速度程序控制)。造模后3 d對大鼠進行+Gz處理，A組大鼠不做處理，B組大鼠地面捆綁(相當于+1 Gz恒速暴露)5 min，C組大鼠+5 Gz旋轉5 min，D組大鼠+10 Gz旋轉5 min，每隔1 d進行1次，持續1周，共4次。

6 GMBF的測定 利用英國MoorVMS-LDF2型激光多普勒血流儀測定血流，1周后大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射麻醉后，打開腹腔，暴露并固定胃部，在幽門部無血管區做0.3 cm的小切口，分別在胃竇、胃體大、小彎及胃底4點測定血流，每點測1 min。于切口處插入血流儀探頭，輕輕接觸黏膜面，待血流穩定后，讀取數據并取其平均值，血流值單位為PU。

7 胃黏膜標本采集 完成GMBF的測定后，取出大鼠的胃，沿胃大彎側剪開，于紗布上展開、鋪平，用刀片輕輕刮取胃黏膜組織置于EP管中-80℃保存，待測。

8 胃黏膜CGRP-mRNA含量測定 采用實時熒光RT-PCR的方法進行定量測定，將組織放入預冷的研缽中加入液氮快速研磨，研磨后的粉末裝入預冷的EP管中進行RNA的提取(具體步驟嚴格按Trizol試劑盒說明書進行)；判斷RNA純度后，將配制的20 μl反轉錄體系物質加入0.5 ml的離心管中進行RNA反轉錄(具體步驟按M-MLV反轉錄試劑盒說明書進行)；所得的cDNA進行Real-Time PCR擴增反應(具體反應參數和步驟按Real-time PCR擴增試劑盒說明書進行)，整個PCR過程由計算機自動收集數據，繪制曲線，并以β-actin作為內參(PCR條件同上)。最后讀取數據，用2-ΔΔCT計算各個樣本CGRP-mRNA的表達變化。CGRP引物序列為：Forward primer 5′-CTCTAGTGTCACTGCCCAGAA-3′，Reverse Primer 5′-CTTCAGAGCCCACATTGGT-3′，片段長131 bp。β-actin引物序列：Forward primer 5′-CCCATCTAT GAGGGTTACGC-3′，Reverse primer 5′-TTTAATGTC ACGCACGATTTC-3′，片段長150 bp。

9 統計學處理 應用SPSS17.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以表示，采用方差分析、直線相關分析等，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 大鼠造模情況 B、C、D組大鼠制備胃潰瘍模型，其中B組1只大鼠因傷口愈合不良于+Gz暴露前死亡；C組沒有死亡大鼠；D組2只大鼠在+Gz暴露過程中死亡。其余大鼠造模成功，不同組大鼠胃竇小彎側可見大小不等的潰瘍病灶。

2 +Gz暴露對大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達和GMBF的影響 B組大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達比A組增加，而B組大鼠GMBF較A組大鼠低，差異均有統計學意義(P＜0.05)；+Gz暴露后，C、D組大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達和GMBF較B組大鼠明顯降低(P＜0.05)；D組與C組比較，胃黏膜CGRP-mRNA表達和GMBF降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

3 不同+Gz暴露下胃潰瘍大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達和GMBF量的相關性 B組、C組、D組大鼠CGRP-mRNA表達和GMBF量存在正向相關關系(r=0.807，P＜0.05)。見圖1。

表1 不同+Gz暴露后大鼠胃黏膜CGRP-mRNA和GMBF的含量Tab. 1 Content of CGRP-mRNA in gastric mucosal and GMBF of rats after exposure to different +Gz ()

表1 不同+Gz暴露后大鼠胃黏膜CGRP-mRNA和GMBF的含量Tab. 1 Content of CGRP-mRNA in gastric mucosal and GMBF of rats after exposure to different +Gz ()

aP＜0.05, vs group A;bP＜0.05, vs group B;cP＜0.05, vs group C

圖 1 不同+Gz暴露下胃潰瘍大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達和GMBF量的相關性Fig. 1 Correlation of the expression of CGRP-mRNA in gastric mucosa and gastric mucosal blood fow of rats with gastric ulcer after exposure to different + Gz

討論

消化性潰瘍是多因素綜合作用導致的身心疾病，飛行員中潰瘍病的高發病率和復發率與他們特殊的工作性質和工作環境有關。國內學者研究飛行員消化性潰瘍的患病特點指出，戰斗機因其飛行時產生的超高加速度，運輸機因飛行時間長等特點，其飛行人員消化性潰瘍的發病率和復發率高于其他飛行員[5]。國外學者Biernacki等[6]研究證明，+Gz可以導致飛行員精神緊張，且高劑量+Gz暴露會增加疾病的發生率。上述研究一方面說明，長時間、高劑量加速度會導致消化道黏膜損傷，影響潰瘍愈合質量而易復發；另一方面說明加速度暴露給飛行員帶來的強烈心理應激會增加了潰瘍的易感性。

CGRP是人和哺乳動物體內存在的一種含37個氨基酸殘基的多肽，相對分子質量為3 786.91 Da，廣泛分布在整個消化道黏膜層、黏膜下、肌間神經叢和小血管周圍，以胃黏膜層密度最高[7]。已有研究顯示，CGRP對胃酸分泌和胃腸運動有明顯抑制作用，可增加胃黏膜血流，增加十二指腸堿性物質的分泌，從而發揮其對消化道黏膜的保護作用[8-10]。有學者在血管水平證明了一些炎癥介質、pH、高乳酸，負荷運動、高低溫、噪聲等環境因素可引起CGRP的釋放增加[11-12]。亦有研究報道，低劑量+(2 ～ 3.5)Gz暴露后，血清中CGRP的含量升高，可能是機體在+Gz條件下產生的對抗和削弱不利因素的一種保護性反應[13]。本課題組前期實驗證明，高+Gz暴露將加重胃黏膜損傷，延遲潰瘍愈合，可能與血清中保護因子CGRP含量降低有關[3.14]。本實驗通過RT-PCR定量顯示，B組大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達高于A組(對照組)，可能因大鼠潰瘍造模后，胃酸分泌增加、炎癥介質釋放、炎癥細胞遷移等直接刺激含CGRP的神經興奮，促進CGRP-mRNA轉錄和釋放；而在+5 Gz暴露后，C組大鼠胃黏膜CGRP-mRNA表達降低，且D組大鼠顯著低于C組，說明高劑量+Gz暴露將導致CGRP-mRNA表達下降，且隨著+Gz增高，其作用更加顯著，與上述研究結果一致。其機制可能為隨著+Gz的增加，超過機體耐受能力時，可能導致胃黏膜CGRP神經功能及內分泌功能降低，使CGRP-mRNA表達下降，組織的抗損傷能力減弱，從而加重了潰瘍的形成，延遲潰瘍愈合。

胃黏膜正常功能的維持依賴于正常的黏膜血供，GMBF可為黏膜細胞提供氧、營養物質及胃腸肽類激素等，還可及時有效地清除細胞代謝產物和過量的H+逆彌散，以維護局部微環境的相對穩定[15-16]。本實驗研究+Gz作用下黏膜血流變化情況，結果顯示B組大鼠GMBF較A組降低，提示潰瘍作為一種組織病理損傷本身會影響黏膜血流；C組GMBF較B組明顯較少，而又明顯高于D組，說明+Gz將導致胃潰瘍大鼠GMBF下降，且+Gz值愈高影響愈顯著。這表明+Gz作用下GMBF下降可能是影響潰瘍愈合的最直接的原因之一?？紤]因+Gz作用下，機體通過自主神經調節作用減少胃腸道血供而優先滿足大腦的需要；其次，+Gz暴露作為一種應激刺激使機體交感神經與迷走神經興奮，導致黏膜血管收縮及黏膜下動靜脈短路開放等；亦可通過改變胃腸肽的表達、細胞因子或一些遞質釋放等調節胃黏膜血流[16-17]。致使胃黏膜缺血、缺氧，能量供應不足，從而影響潰瘍愈合。

本實驗及課題組前期試驗結果顯示：在+Gz暴露條件下，血清中CGRP含量和胃黏膜CGRP-mRNA表達降低，二者變化情況與+Gz對胃黏膜血流的作用一致，表明+Gz可減少胃黏膜血流量，延遲潰瘍愈合，其機制可能與調節CGRP-mRNA的表達有關。GMBF對胃黏膜保護及促進潰瘍修復的作用較為肯定，且有研究表明辣椒素敏感神經元及其釋放的降鈣素基因相關肽是其調節因子之一[18]。組織學發現胃黏膜下小動脈周圍致密地圍繞著辣椒素敏感傳入神經纖維，以低濃度辣椒素灌注大鼠胃可引起血液中CGRP含量提高，同時GMBF顯著增加[19]。

總之，CGRP除對胃腸分泌和胃腸運動有抑制作用外，作為最強的舒血管物質，對GMBF的作用也較為肯定。本實驗研究+Gz條件下胃黏膜CGRP-mRNA和GMBF的變化情況及相關關系，表明+Gz暴露導致潰瘍愈合延遲，其原因可能與+Gz作用下CGRP-mRNA表達減少和GMBF降低有關。因此，啟示臨床工作者，對于潰瘍病飛行員，恢復胃黏膜正常血供，將有助于潰瘍的愈合，減少短期內復發的可能性，CGRP途徑可能為治療提供一種新的靶點。

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Effects of positive acceleration on the expression of CGRP-mRNA in gastric mucosa and gastric mucosal blood fow of rats with experimental gastric ulcer

ZHAO Kun1, CHEN Ying1, LI Jing1, FAN Qin2, TANG Helan1, YANG Chunmin1, WANG Jianchang3
1Cadres Ward; Department of Gastroenterology;2Department of Anesthesiology;3The Hospital Office General Hospital of Air Force of Chinese PLA, Beijing 100142,China

YANG Chunmin. Email: chunmyang@sina.com

ObjectiveTo study the effects of positive acceleration (+ Gz) on CGRP-mRNA in gastric mucosal and gastric mucosal blood fow of rats with experimental gastric ulcer and the related mechanism of the effect on ulcer healing.MethodsForty male SD rats were randomly and equally divided into four groups. Rats in group A was the normal control group without exposure to constant + Gz. The gastric ulcer was induced with acetic acid in rats of group B, C, D. After 3 d, rats in group B were bound on the ground for 5 min (exposure of constant + 1 Gz). Accordingly, the rats of group C and D were respectively exposed to + 5 Gz and + 10 Gz for 5 min (once every other day, 4 times in all). After 1 week, GMBF of rats which were anesthetized and fxed frstly was measured with the MoorVMS-LDF2 laser doppler blood fow meter. Gastric mucosa were collected to determinate quantitatively CGRP-mRNA in gastric mucosal by fuorescence quantitative PCR.ResultsThe content of CGRP-mRNA of rats in group B (3.090±0.154) was higher than that in group A (0.966±0.089, P＜0.05). After exposure to + Gz, the content of CGRP-mRNA of rats in group B＞group C (2.262±0.116)＞group D (1.096±0.077), and all differences were statistically signifcant (P＜0.05). For the content of GMBF, group A (432.919±11.598) pU＞group B (367.602±10.133) pU＞group C (303.925±16.417) pU＞group D (246.750± 22.815) pU. The differences were statistically signifcant (P＜0.05). The content of CGRP-mRNA and GMBF in gastric mucosal of rats (rats in group B, C, D) with gastric ulcer had positive correlation after exposure to different +Gz (r=0.807, P＜0.05).Conclusion+ Gz exposure delays gastric ulcer healing of rats, which may be related to the reduction of GMBF and alteration in the expression of CGRP – mRNA after exposure to + Gz.

positive acceleration; stomach ulcer; gastric mucosal blood fow; calcitonin gene-related peptide-mRNA

R 573.1

A

2095-5227(2015)01-0075-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.01.024

時間：2014-08-29 17:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140829.1714.004.html

2014-06-25

全軍十二五后勤科研計劃基金資助項目(AKJ11J004)

Supported by the 12th Five Years Major Scientific Research Program of General Logistics Department of PLA(AKJ11J004)

趙錕，女，碩士，醫師。研究方向：航空航天醫學消化方面。Email: zhaokun1020@163.com

楊春敏，男，博士，主任醫師。Email: chunmyang@sina.com