瘋牛病檢測技術最新研究進展

郭家鵬，朱利峰

（1.河南省動物衛生監督所，河南　鄭州　450008；2.河南省畜牧獸醫服務中心）

瘋牛病檢測技術最新研究進展

郭家鵬1，朱利峰2

（1.河南省動物衛生監督所，河南鄭州450008；2.河南省畜牧獸醫服務中心）

瘋牛病（BSE）的流行給許多國家的畜牧業帶來了巨大的經濟損失，并不斷威脅人類健康。對于瘋牛病的防制，有效的檢測技術起十分重要的作用。對近年瘋牛病檢測技術的發展進行總結和展望。

瘋牛?。浑貌《?；畜牧業；檢測技術

傳染性海綿狀腦?。═SE）是一類引起人和動物神經組織退化的疾病，包括人的庫魯病、克-雅氏病、吉-斯綜合征、阿爾茨海默病以及動物的瘋牛病、羊瘙癢病等。其中瘋牛病發現的最早，動物采食含有朊病毒的肉骨粉可能引起該病的發生［1］。該病對養牛業發展和人類健康構成巨大威脅，并有“東擴”蔓延的趨勢，已成為國際獸醫學界和醫學界共同關注的熱點問題。

1　瘋牛病流行狀況及其檢測技術研究的重要性

1.1瘋牛病的病原

瘋牛病的學名為牛海綿狀腦?。˙SE），病原為朊病毒，是一種無核酸的蛋白性侵染顆粒，屬慢性進行性致死性神經系統疾病。目前認為BSE的病原為癢病相關纖維（SAF），這種纖維源自非常規變異蛋白（PrPsc），它的存在是BSE的一大特征。發生變異的蛋白引發人和動物的腦組織形成海綿狀空洞，腦神經會漸漸變得像疏松的海綿體，腦功能出現退化，行動失去控制，四處盲目沖撞直至死亡。這就是瘋牛病及其與人類相關的克-雅氏癥等疾病的病因?？茖W家經過多年的研究還發現，老年癡呆癥的病變蛋白與其有驚人的相似，它們在化學致病機制上有許多類似性。

1.2瘋牛病的流行狀況

1986年，英國首先發現并報道該病，1987年正式命名為牛的海綿狀腦病，并且在世界上公開報道。1986年，英國首先發現并報道了14個病例，以后發病趨勢加快，至1993年達到了高峰，病牛達到了3.7萬多頭。到1999年7月，英國確認的病例有17萬多頭。最新統計全球共有瘋病牛20多萬頭，其中英國占180 376頭，歐洲是重災區［2］。除英國大規模的暴發外，美國、法國、德國、日本、荷蘭、葡萄牙、西班牙、意大利、愛爾蘭、瑞士、比利時、盧森堡、丹麥等20多個國家和地區發生了瘋牛?。?］。但是這些國家基本上是散發性的，只有英國是大規模流行。瘋牛病近年出現了東擴的趨勢，日本已證實了瘋牛病的發生，并且流行趨勢相當嚴峻，不斷有新病例發生的報道［4］。

1.3瘋牛病檢測研究的重要意義

瘋牛病潛伏期比較長，一般為4至5年，而且機體不能對其產生免疫反應，對人類和動物都有極大的威脅性。強調瘋牛病的嚴重性，不僅是因為瘋牛病傳染給人后會使人患上克-雅氏癥，更因為人類目前對瘋牛病還沒有有效的防治和治療措施，所以檢測和診斷就顯得尤為重要。

2　目前瘋牛病檢測技術的研究水平

目前，世界各國對瘋牛病的檢測尚無經濟實用、簡便高效的方法。對瘋牛病的檢測步驟一般為：先根據臨床特征和流行病學資料做出初步診斷，再根據病理組織學變化、免疫學以及分子生物學檢測等方法確診。隨著生物學及生物學相關邊緣科學的發展，出現了許多新的檢測方法。

2.1病理組織檢測方法

可疑BSE病例被屠宰后，首要的診斷方法是病理組織學檢查，當發現BSE特征性病變即海綿狀空洞即可確診。BSE病牛具體病理組織學變化是：腦兩側灰質神經叢對稱性海綿樣病變和腦干神經核神經元空泡化，以腦組織中淀粉樣核心周圍有由海綿樣變性形成的“花瓣”組成的雛菊花樣病理斑為特征。

2.2生物鑒定方法

通過被檢標本勻漿（腦、脊髓、脾等）接種小鼠或倉鼠，接種動物3 d檢查1次，瀕死撲殺取腦組織做病理學檢查。最后根據動物發病和死亡數計算終點滴度。倉鼠觀察期為7～8個月，小鼠為12～36個月，而且代價高昂，臨床不常采用［1，5］。

2.3免疫學檢測方法

BSE診斷的實際應用需要更加快速并且可同時檢測大量樣本的方法，目前有多種免疫診斷技術可區分正常和異常的朊病毒蛋白，其中有些能精確確定朊病毒蛋白含量水平。

2.3.1免疫細胞化學法（ICC）

ICC試驗利用抗原直接在組織切片上檢查PrPsc。試驗從每個腦組織上分別取延髓、腦橋、中腦、丘腦、大腦皮質、小腦組織做成切片，在切片上滴加第一抗體（如鼠抗PrP單克隆抗體FH11），第二抗體為標記有生物素的馬血清。若病理組織切片中有PrPsc，就會與第一抗體結合，隨后與第二抗體結合。再加入ABC（Avidin+ Biotin-peroxidase complex）試劑，后者可結合到第二抗體上。之后再加入底物（H2O2），即可出現反應。最后用蘇木素復染，PrPsc呈紅褐色。陽性對照切片是羊癢病腦組織切片，從而鑒定樣品中有無瘋牛病病原［6］。

2.3.2免疫組織化學法

免疫組化是利用標記的特異性抗體來顯示組織切片上的PrPsc。其基本步驟是：將甲醛固定或石蠟包埋的組織標本經一系列預處理后，依次與特異性抗體和酶標記二抗反應，最后加底物顯色，顯微鏡下觀察。用該方法檢測靈敏度、特異性都很高，且具有高度的解剖學分辨率，已成為傳染性海綿狀腦病的標準檢測法［7-8］。有關專家利用該方法對英國和意大利的瘋牛病的檢測進行比較得到了相同的檢測結果，進一步說明了該方法的可靠性。法國食品公共衛生部研究出的石蠟包埋斑點法（PET-blot）也可以用來檢測受感染的腦組織。

2.3.3免疫印跡法

瑞士Prionics公司是瘋牛病和羊癢病等朊病毒疾病早期診斷的全球領先企業。Pronics公司開發的免疫印跡法采用Westernblot法檢測朊病毒蛋白，需要6 h就能出檢測結果，這種方法現在被瑞士政府和英國授權用于牛的瘋牛病管理，并可用于對潛伏期動物進行檢測。目前，歐洲委員會建議，在歐盟監管項目的瘋牛病檢測中采用新型Prionics（R-Check LIA）法，LIA專門設計用來進行BSE檢測，具有很高的精確性和可靠性。歐委會瘋牛病專家的評估顯示出百分之百的敏感性和特異性［9］。

2.3.4ELISA法

愛爾蘭Enfer Scientific公司的ELISA法采用了新的抽取技術，利用化學熒光和多細胞抗-PrP抗體進行檢測，約24 h出結果。這種檢測方法已被愛爾蘭政府應用于感染BSE的牛監測。法國和英國的Bio-Rad公司開發的Platelia試驗和TeSeE試驗采用夾心免疫法，約4 h出結果，該方法使用兩個單克隆抗體，第一個抗體在固相中被免疫，而第二個抗體用共價酶做標記，PrP通過測量這種酶的活性來檢測。該方法尤其適用于有大量樣本的情況，與傳統接種動物的方法平行對比，檢測感染BSE牛腦組織稀釋樣本，準確性好，并有可能用于檢測處于潛伏期的標本。日本東京Fujirebio公司研發的一步法ELISA試驗將牛腦組織制備成勻漿懸液后，先用DNAse I和膠原酶（Collagense）處理，再用蛋白酶消化。之后，依次經過蛋白沉淀，耐受蛋白酶蛋白水解折疊，水浴超聲懸浮，將懸浮物加到包被有特異單克隆抗體的微孔板，再加入HRP標記的檢測抗體，TMB顯色等試驗步驟后，用酶標儀讀取結果，顯示出了很高的檢測準確性。

2.3.5構象依賴性免疫測定法

美國加州大學舊金山分校（UCSF）的研究人員開發出的構象依賴性免疫測定方法（CDI），比現在應用的普通免疫測定方法能檢測出更微量的prion蛋白，而且5 h即可出結果。該方法將可用于檢測活動物而且準確性相當高，對西班牙、德國和英國的11 000頭屠宰牛檢測結果完全與現在應用的方法相符，而且在實驗室和臨床試驗中，還沒有發現假陰性或假陽性結果。另外，該方法的另一突出優點是自動化，因此可以用于大量動物的篩選［10］。

2.3.6免疫熒光法

EGG Wallac的基于免疫熒光方法的Delfia試劑，敏感性比較高，該方法檢測是使用兩個單克隆靶PrP的非競爭性檢測方法，英國的農漁食品部（MAFF）已同意將其用于檢測英國的牲畜。德國學者研制出利用熒光相關光譜檢測瘋牛病的方法，可以不用蛋白激酶K進行消化，這對于潛伏期動物的診斷有很大的優勢。

2.3.7高效色譜免疫分析法

高效色譜免疫分析法于2004年被歐盟委員會接受用于瘋牛病的檢測，巴薩羅那大學研究的Prionics-Check PrioSTRIP是一種針對瘋牛病開發的高效色譜免疫分析法，也有很高的可靠性。

2.3.8雞卵黃抗體檢測

日本廣島大學、國家動物健康研究所和廣島科技研究所的研究人員重組了一種可以檢測瘋牛病的雞卵黃抗體（IgY），這種抗體的可變區包括Ab3-15和Ab4-19兩個抗哺乳動物朊病毒蛋白的區域，從而能敏感的識別PrPsc蛋白準確檢測瘋牛病。

2.4分子生物學檢測方法

2.4.1Westernblotting檢測法

中國農業大學國家動物海綿狀腦病實驗室的王輝暖、趙德明等于2007年以朊蛋白單抗AH6和堿性磷酸酶標記的馬抗鼠酶標二抗建立了瘋牛病和羊癢病的Western blotting檢測方法。其敏感性為100%，特異性為99.4%，與進口試劑盒無顯著差異，這為國產試劑盒研制提供了條件［11］。國家瘋牛病參考實驗室利用小鼠骨髓瘤細胞和經過重組魯西黃牛PrP或重組小尾寒羊PrP免疫的脾細胞建立了5個雜交瘤細胞系。經過Western blot反應，其中有4組可以識別牛和羊的re-PrP、PrPc和PrPsc，兩組只能識別羊的re-PrP和PrPsc，對牛和羊的PrPc都不能識別，利用此方法可以進行瘋牛病的監測。荷蘭動物疾病中心利用咽喉淋巴結進行Western blotting檢測，不但能檢測瘋牛病而且可以區分瘋牛病和羊癢病。

2.4.2瘋牛病特殊風險物質熒光RT-PCR檢測法

北京出入境檢驗檢疫局的史喜菊等人建立了檢測牛肉中瘋牛病特殊風險物質（主要是中樞神經組織）標記物膠原纖維酸性蛋白（GFAP）mRNA的熒光RT-PCR檢測技術。能從牛源和羊源的中樞神經組織中檢測到GFAP［12］。

2.4.3利用紅細胞分化相關因子（EDRF）檢測法

英國的中洛錫安群羅斯林研究所的Gino Miele等人利用cDNA的差異顯示分析，來鑒定在朊蛋白疾病中具有異常表達的EDRF轉錄物。朊病毒侵入大腦前首先在脾臟復制，由此他們推測朊病毒可能會影響基因表達，于是他們分析了來自正常小鼠脾臟和BSE感染小鼠脾臟的RNA轉錄物。結果發現，在感染小鼠的脾臟中，EDRF的轉錄水平下降，不僅如此，受感染小鼠的血液和骨髓也存在EDRF的減少，在羊癢病患羊和BSE患牛的骨髓中，EDRF的水平同樣低于正常。由此判斷不論EDRF是否參與致病，它可能會成為很好的診斷標記物。

2.4.4利用標記核糖核酸檢測法

2004年德國吉森獸醫與食品研究所米夏埃爾·比爾特教授等開發出利用核糖核酸（RNA）作為標記物的檢測方法。動物中樞神經系統中含有膠質纖維酸性蛋白，而合成這種蛋白質的過程中會產生信使RNA，通過實時聚合酶鏈反應，就能找到信使RNA的痕跡，進而判斷肉類食品中是否摻入了含有瘋牛病病毒粒子的腦或脊髓組織［13］。

2.5其他檢測方法

2001年，美國和英國合作研制出通過檢測尿液診斷瘋牛病的方法?？蓹z測到病牛尿液中的瘋牛病因子，而且特異性很好［14］。俄羅斯科學家用人工方法合成了瘋牛病的普里昂蛋白質，并培育出有彩色標記、能攻擊正常的普里昂蛋白質的抗體。檢測前先向腦組織中注入一種酶，這種酶只能與正常的普里昂融合在一起。由于人工抗體帶有彩色標記，故顯微鏡下所有普里昂蛋白質周圍都會出現彩色亮點。通過觀察這些蛋白質是否與特殊酶發生融合，便可以分辨出是否有變異普里昂蛋白質（未與特殊酶融合的）存在，從而可以斷定被測的牛是否患上BSE［15］。

2003年，英國根據瘋牛病感染牛出現異常的腦電圖的現象，將其作為瘋牛病的生前診斷，英國腦電圖診斷法作為法定的診斷方法［16］。同年，英國四家機構的神經學家和輻射學家稱，利用磁共振影像，以高功率將焦點集中于大腦的中央部位的尾丘腦。瘋牛癥典型特征的腦細胞喪失的形狀，就會在影像的黑斑中顯示出來，因此，也可利用此法進行瘋牛病的診斷［17］。

2004年，美國北達科他州立大學（NDSU）科研人員研究出使用無線射頻識別技術（RFID）來檢測瘋牛病的方法［18］。

2005年，日本九州大學研究出對異常普里昂蛋白質有特殊捕捉能力的有機分子和電化學顯色劑相結合的電極裝置檢測法，該方法不但精確度高，節約檢測時間，而且可以用于20個月以下小牛的檢測［19］。

2007年，德國科學計算跨學科中心和Heidelberg大學研究利用紅外光譜特征檢測活牛血清來診斷牛是否染上瘋牛病。同年，多位科學家研究發現構成朊蛋白基因（PRNP）的多態性和瘋牛病的發生有很強的關聯性，通過該項檢測也可以間接確定瘋牛病的發生。

3　瘋牛病檢測技術研究發展方向

瘋牛病活體檢測是當前和今后一段時間內瘋牛病研究的難點和重點。目前已取得了一些進展：除了前面所提到的尿液診斷法、腦電圖診斷法、磁共振影像法、無線射頻識別法、紅外光譜特征檢測活牛血清法、血纖維蛋白溶酶原早期檢測法。其他的方法還有：荷蘭研究的活體動物采血檢測法；英國曼徹斯特大學利用心電圖來監測在感染BSE的早期階段的心率變異信號，從而來檢測瘋牛病以及診斷人類變異克雅氏病；德國哥廷根大學開發出一種在活牛身上檢測瘋牛病的血液檢測法［20］。

我國目前沒有發現瘋牛病，但從其發病機理和我們與國外在畜牧業方面的貿易往來史看，仍然不能放松警惕。在歐洲真正認識瘋牛病之前，我們從英國等歐洲國家引進種羊和種牛的同時就有可能埋下了隱患。國內基層對瘋牛病認識不足，缺乏有效、快速的檢測手段，瘋牛病可能隨著經濟交往和人員交流而形成全球化。所以目前當務之急就是找到一種特異性高、簡便、非創傷性和有早期診斷意義的檢測方法。鑒于目前對瘋牛病檢測試驗需要的迫切性，相信這些問題很快會得到解決。

［1］蔡寶祥.家畜傳染病學［M］.中國農業出版社，2001：176-182.

［2］陳豪泰，張杰，劉永生，等.瘋牛病與新型克-雅病研究進展［J］.基礎醫學與臨床，2005，25（12）：1090-1094.

［3］何煒，李向臣.瘋牛病與朊蛋白的研究進展［J］.安徽農業科學，2007，35（25）：7853-7865.

［4］章田，雅龍，日厚生勞動省證實日出現首例人體感染瘋牛病病例［EB/OL］.http：//www.chinanews.com.cn/news/ 2005/2005-02-04/26/537417.shtml，2005-02-04.

［5］李逸，劉婷婷.快速檢測瘋牛病［J］.科學，2004，（9）：52-59.

［6］馬貴平，張寶云，李冰玲，等.瘋牛病感染因子的檢測［J］.畜牧獸醫學報，2003，34（4）：394-397.

［7］馬貴平李炎鑫，趙德明.瘋牛?。˙se）的檢測方法［J］.中國動物檢疫，2005，22（4）：32-33.

［8］宋宏新，程軍.瘋牛?。˙se）的檢測、預防及控制［J］.中國人獸共患病雜志.2005，21（3）：256-258.

［9］儀信.瘋牛病檢測新系統面世［N］.醫藥經濟報，2003-03-24.

［10］郭志儒.更快、更準確的瘋牛病檢測方法出臺［J］.中國獸醫學報.2004，24（1）：3.

［11］王輝暖，趙德明，寧章勇，等.瘋牛病和羊癢病Western blotting檢測方法的建立［J］.中國獸醫學報，2007，27（1）：66-73.

［12］史喜菊，馬貴平，李冰玲，等.牛肉中瘋牛病特殊風險物質熒光RT-PCR檢測方法的建立［J］.農業生物技術學報，2007，15（5）：752-756.

［13］劉向.檢測瘋牛病肉制品有新法［N］.新華每日電訊，2004-04-03，（008）.

［14］郭志儒.美英公司合作研制出通過尿液檢測瘋牛病的方法［J］.中國獸醫學報.2001，（6）：551.

［15］欒海.俄羅斯發明瘋牛病檢測新法［J］.飼料與畜牧，2001，（2）：35.

［16］孫亞軍.瘋牛病研究進展［J］.國外醫學，2003，30（5）：302-307.

［17］陳凡，何啟蓋，金梅林，等.瘋牛病研究進展［J］.養殖與飼料，2003，（9）：37-38.

［18］上?？平膛d農網.美科學家稱可用無線射頻識別技術檢測瘋牛?。跩］.中國牧業通訊，2004，（3）：56.

［19］何德功.日本開發出快速檢測瘋牛病的裝置［J］.新農村，2005，（5）：23.

［20］劉向.德國開發出活體瘋牛病檢測方法［J］.中國牧業通訊，2005，（16）：21.

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