復方馬度米星銨預混劑中尼卡巴嗪含量測定方法的研究

劉素梅，杜紅鴿，方忠意，張躍京，臧和英，邱天寶，王　麗

（河南省獸藥飼料監察所，河南 鄭州 450008）

復方馬度米星銨預混劑中尼卡巴嗪含量測定方法的研究

劉素梅，杜紅鴿，方忠意，張躍京，臧和英，邱天寶，王麗

（河南省獸藥飼料監察所，河南 鄭州 450008）

建立了高效液相色譜法測定復方馬度米星銨預混劑中尼卡巴嗪的含量，采用Waters X-Bridge C18（150 NN 4.6 mm，5 μm）色譜柱，乙腈-水（用磷酸調pH至3.0）為流動相，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測波長0～5 min為297 nm，5 min開始為350 nm，柱溫30℃，進樣體積為20 μl。HDP的回歸方程為：y=23452x-456，相關系數r=0.99999，DNC的回歸方程為：y=102388x+5296，相關系數r=0.9999，即HDP在0.29～29.12 μg/ml范圍內具有良好的線性，DNC在0.71～70.90 μg/ml范圍內具有良好的線性。該方法簡便、準確、靈敏度高、重復性好，可以通過同時測定尼卡巴嗪中HDP和DNC來計算尼卡巴嗪的含量。

復方馬度米星銨預混劑；尼卡巴嗪；HDP；DNC；高效液相色譜法

復方馬度米星銨預混劑收載于農業部公告第1435號［1］中，為尼卡巴嗪和馬度米星銨的復方制劑，作為飼料添加劑用于防治雞球蟲病。方中尼卡巴嗪為4，4′-二硝基均二苯脲（DNC）和2-羥基-4，6-二甲基嘧啶（HDP）的復合物，對雞的多種艾美耳球蟲，如柔嫩、脆弱、毒害巨型、堆形、布氏艾美耳球蟲均有良好的防治效果［2］。

標準中尼卡巴嗪含量測定采用的紫外分光光度法，并且通過只測定4，4′-二硝基苯脲（DNC）的含量來控制尼卡巴嗪的含量，樣品需經反應顯色，操作較煩瑣，且樣品溶液不穩定，重現性差，每次顯色后必須快速測定，無法同時測定多批樣品。只有沈祥廣等［3］通過高效液相色譜法對HDP和DNC進行了同時測定，但該方法流動相配制煩瑣，且HDP易和溶劑峰重合在一起。根據獸藥典委員會的要求，將尼卡巴嗪原料及制劑中尼卡巴嗪含量測定方法進一步完善，修訂為高效液相色譜法，并擬將該標準收載在《中國獸藥典》2015年版中。

1　儀器與試藥

Waters Alliance高效液相色譜系統：包括2695分離系統、2489紫外檢測器、Empower2色譜工作站；METTLER XP205電子天平；MILIPORE超純水處理器等。

復方馬度米星銨預混劑由濮陽泓天威藥業有限公司（批號為GR201307002）、河南孟成生物藥業股份有限公司（批號為20130701）和浙江匯能動物藥品有限公司（批號為413022518）提供；尼卡巴嗪對照品由中國獸醫藥品監察所提供，批號為H0330903；液相用甲醇、乙腈為色譜純試劑，水為超純水，其他試劑為分析純。

2　方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取尼卡巴嗪對照品50 mg，置50 ml量瓶中，加二甲基亞砜20 ml，超聲使溶解，加乙腈稀釋至刻度，搖勻；臨用前用乙腈-水（6∶4）稀釋成濃度為1、5、10、40、80和100 μg/ml的系列對照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜即得。

2.1.2供試品溶液的制備取本品0.63 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加二甲基亞砜20 ml，超聲提取20 min，加乙腈稀釋至刻度，搖勻；精密量取上清液2 ml，置50 ml量瓶中，加乙腈-水（6∶4）稀釋至刻度，搖勻。

2.2色譜條件的選擇

尼卡巴嗪中HDP具有較大的極性，在反相色譜柱上保留較弱，很容易和溶劑二甲基亞砜重合在一起，參考不同文獻［4-7］，選取C18柱為色譜柱，考察不同的溶劑系統，最終采用乙腈-水（用磷酸調節pH值至3.0i 0.1）系統［8］。考慮到HDP保留較弱，出峰快，DNC出峰慢，且預混劑所用輔料為玉米芯，空白輔料有吸收峰，為避免這些吸收峰對組分的影響，選用了梯度洗脫，具體程序見表1。

表1　梯度程序表

經光電二極管陣列檢測器檢測，HDP的最大吸收波長為297 nm，DNC最大吸收波長為350 nm，所以在檢測過程中需要切換波長，0～5 min為297 nm，5 min開始為350 nm。

2.3線性范圍

精密稱取尼卡巴嗪對照品50 mg，置50 ml量瓶中，加二甲基亞砜20 ml，超聲溶解，加乙腈定容至刻度，搖勻；用乙腈-水（6∶4）稀釋成濃度為1、5、10、40、80和100μg/ml的系列對照品溶液，過0.45 μm微孔濾膜，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品溶液濃度與相應的組分峰面積算回歸方程和相關系數，HDP的回歸方程為：y=23452x-456，相關系數r=0.99999，DNC的回歸方程為：y=102388x+ 5296，相關系數r=0.9999，即HDP在0.29～29.12 μg/ml范圍內具有良好的線性，DNC在0.71～70.90 μg/ml范圍內具有良好的線性。

2.4準確度

取空白輔料0.63 g，共取9份，精密稱定，分別加入尼卡巴嗪原料40 mg、50 mg和60 mg共3個濃度水平，每個水平3份。按照2.1.2項下供試品制備方法進行處理，進高效液相色譜儀分析，按外標法以峰面積計算，結果見表2。

表2　復方馬度米星銨預混劑準確度試驗結果

從結果可以看出，采用高效液相色譜法同時測定兩個組分的含量，回收率高。

2.5精密度

取同一批次樣品0.63 g，共取6份，分別精密稱定，按2.1.2項下供試品制備方法進行處理，進高效液相色譜儀分析，按外標法以峰面積計算含量，HDP的RSD為0.8%，DNC的RSD為0.4%，結果表明，該方法具有很好的精密度。

2.6專屬性

經過考察生產企業的復方馬度米星銨預混劑生產工藝，在生產過程中使用的可能影響到藥物成分質量的試劑有苯甲醇和乙酸乙酯，筆者考察了這兩種試劑對尼卡巴嗪色譜峰的影響。稱取空白輔料0.63 g，分別加入1ml的苯甲醇和乙酸乙酯及2 mg的馬度米星銨，按2.1.2項下供試品制備方法進行處理，進高效液相色譜儀分析，在該色譜條件下尼卡巴嗪兩主峰無干擾。

2.7穩定性

取供試品0.63 g，按2.1.2項下供試品溶液制備方法進行處理，分別在0、1、8、12和24 h進樣，考察供試品溶液穩定性，兩組分峰面積RSD分別為0.8%和0.5%，結果顯示，樣品在24 h內穩定。

2.8耐用性

用XBridge C18（5 μm，4.6 ON 150 mm）色譜柱分別考察了不同柱溫、不同流速和流動相不同pH值對色譜峰的影響，結果發現，不同柱溫和不同流速對色譜峰的柱效、分離度等影響不大。流動相的水相pH值為2.5和3.5時，兩主峰的理論塔板數下降幅度很大，pH值為3.5時，DNC峰展寬，出現肩峰；pH值為2.8和3.2時，兩主峰的理論塔板數分別較pH值為2.5和3.5提高很多，能達到標準需求，所以pH值應盡量控制在3.0i 0.2。

2.93批樣品測定

取3批復方馬度米星銨預混劑，每批3份，分別精密稱定，按2.1.2項下供試品溶液制備方法進行處理，進高效液相色譜儀分析，按外標法以峰面積計算含量及RSD，結果見表3。

表3　三批樣品測定結果

由表3可知，該方法重復性好，可以實現HDP和DNC的同時測定。

3　討論與結論

原標準中尼卡巴嗪含量測定采用的紫外分光光度法，并且通過只測定4，4′-二硝基苯脲（DNC）的含量來控制尼卡巴嗪的含量，供試品經反應顯色，操作較煩瑣，且樣品不穩定，重現性差。修改后采用高效液相色譜法，兩種組分同時測定，結果以兩組分含量的和來計算，操作較原來簡便了好多，樣品的重現性很好，較原來的方法有很大的優越性。

HDP保留較弱，DNC保留很強，出峰慢，且預混劑所用輔料為玉米芯，空白輔料有吸收峰，為避免這些吸收峰對組分的影響，選用了梯度洗脫。

該方法簡便、快速、重復性好，可以進行大批量樣品的同時測定，對尼卡巴嗪中的兩個組分進行控制，可以更好地控制制劑的質量。

［1］農業部獸藥評審中心.農業部公告第1435號［S］.2010.

［2］中國獸藥典委員會.獸藥使用指南化學藥品卷［S］.2011.

［3］沈祥廣，賀利民，余靜賢，等.尼卡巴嗪原料藥及制劑中4，4′-二硝基均苯二脲與2-羥基-4，6-二甲基嘧啶的HPLC法同時測定［J］.分析測試學報.2010，29（5）：523-526.

［4］邵慶均，張金枝，宣士榮，等.反相高效液相色譜法測定飼料中尼卡巴嗪含量［J］.分析化學.2003，31（11）：1376-1379.

［5］陳麗，譚寶玲，馮建文.HPLC法檢測飼料預混劑中尼卡巴嗪的含量［J］.飼料工業.2006，27（14）：52-53.

［6］孫雷，張驪，劉智宏，等.雞蛋和雞肉中尼卡巴嗪殘留檢測高效液相色譜-串聯質譜法研究［J］.中國獸藥雜志. 2008，42（5）：1-4.

［7］周偉偉，鐘平，薛偉芳，等.雞組織中尼卡巴嗪殘留HPLC檢測方法的研究［J］.中國獸醫學報.2009，29（12）：1590-1592.

［8］劉素梅，班付國，韓立，等.高效液相色譜法測定尼卡巴嗪含量的方法建立［J］.中國獸藥雜志.2014，48（5）：51-55.

S859.79

1004-5090（2015）11-0005-03

2015-08-21）