細胞永生化機制及不同細胞永生化方法研究進展

黃今，楊融輝，馬海英

(中國醫科大學基礎學院 病理生理學教研室，遼寧 沈陽 110001)

·綜 述·

細胞永生化機制及不同細胞永生化方法研究進展

黃今，楊融輝，馬海英

(中國醫科大學基礎學院 病理生理學教研室，遼寧 沈陽 110001)

永生化細胞是一種在理化刺激、基因突變、病毒感染等外界刺激下，可以在體外無限增殖的不衰老細胞株。細胞永生化機制有放射性因素、端粒-端粒酶激活、病毒基因轉染及抑癌基因受抑制等學說。作者在總結細胞永生化原理的基礎上闡述不同組織細胞永生化的技術方法及生長狀態。

細胞永生化； 體外培養； 端粒酶； 病毒； 癌基因； 文獻綜述

細胞永生化是指細胞在體外培養的過程中，由于自身基因變化或者外界各種刺激因素，避免了正常細胞的衰老死亡過程，可以長期傳代培養、無限分裂增殖[1]。對細胞永生化發生機制的研究雖然已經取得了很大的進展，但是不同細胞永生化的機制不盡相同。作者在總結細胞永生化基本機制的基礎上探討不同細胞永生化研究的進展。

1 細胞永生化機制

衰老死亡是一種正常的不可逆的細胞生理過程，細胞在不斷增殖分裂的過程中會到達衰老期M1期和致死期M2期[2]，細胞會停止分裂并啟動凋亡程序。此時如果細胞在某些原因誘導下，恢復基因的穩定性，則可以逃離衰老死亡的正常生理過程達到無限增值分裂的永生化狀態。

1.1 放射性因素

自1996年有學者在核彈輻射后的人體表面發現可以無限增殖的上皮細胞后，通過電離輻射、核輻射、X射線等照射使細胞得到永生化的方法相繼被成功研究出來[3]。通過對成功永生的細胞核型的分析，推測是由于放射性因素使細胞染色體重組，抑癌基因表達被抑制，促進延長細胞壽命的基因表達，使端粒長度得以維持，細胞衰老程序無法穩定進行，細胞可以無限增殖分裂[4]。

1.2 端粒-端粒酶激活

端粒是存在于真核細胞內染色體首尾末端，由簡單重復的DNA序列和周圍蛋白質構成的特有帽狀結構，長度在5～15 bp，具有重要的生理功能，包括維持染色體結構和位置的穩定，防止染色體被化學酶降解，調節細胞正常功能和決定細胞壽命等[5]。端粒隨著細胞不斷分裂會持續丟失，到一定長度閾值后會啟動基因損傷檢測點，導致細胞停止分裂并走向衰老進程[6]。因此，端粒的長度是評價細胞衰老的指標之一。端粒酶是一種催化端粒自我復制，增加端粒長度的逆轉錄酶，同時也是調控細胞周期的重要生物因子。其功能是通過對自身RNA序列的轉錄形成新的端粒DNA序列，以補充縮短缺失的端粒，維持端粒的長度和細胞的無限分裂[7]。

正常細胞中活性端粒酶的水平很低并且受到細胞基因嚴格調控，在原代培養的細胞中發現，端粒酶陽性表達的細胞中人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)的水平也很高。研究證明hTERT作為端粒酶的催化亞基，與相關蛋白結合可以激活端粒酶，延長體外細胞培養的生存周期，是端粒酶的正向調控因子[8]。因此，hTERT基因的表達激活是細胞永生化的重要步驟。

1.3 病毒基因轉染

現有實驗表明，將一些致瘤病毒如猴腎病毒SV40、EB病毒、乳頭狀皰疹病毒等轉化到人正常細胞內，可以改變正常基因，使部分細胞成功渡過兩個致死期，得到無限增殖的能力，達到永生化的狀態[9]。

1.3.1SV40病毒 SV40病毒是一種由LT和st兩種抗原及相關蛋白組成的簡單真核病毒，由于其對細胞生長、轉化、瘤化的高效性，目前已成為真核細胞生物工程實驗的探針型實驗工具[10]。SV40誘導細胞轉化過程涉及很多因素，過程非常復雜，其中LT片段對轉化的啟動起到決定性的作用[11]。將SV40病毒導入目的細胞核內，細胞抑癌基因p53和pRb會與LT抗原片段上相關結合區域結合，使抑癌基因失效無法表達，從而防止細胞分裂停滯，使其無限增殖并表現出多種與腫瘤相關的轉化顯型[12]。

1.3.2EB病毒 EB病毒是一類含雙股線性DNA的皰疹病毒，可以與體外培養的B淋巴細胞融合，通過病毒基因組內潛伏基因的顯性表達，改變細胞生命周期[13]。有研究發現被轉染的淋巴細胞內抑癌基因如p53的轉錄表達水平有所上升，但是細胞壽命未見縮短，證明EB病毒可以抑制抑癌基因發揮活性效應，具有使淋巴細胞永生化的潛力[14]。

1.3.3人乳頭狀瘤病毒(HPV) HPV是一種對上皮細胞有高度特異性的DNA病毒，因其可以轉染上皮細胞增殖成乳頭狀瘤而引起學者廣泛關注。在HPV的編碼基因中，E6和E7基因是誘導細胞永生化的重要因素，其編碼的轉化蛋白不僅可以封閉抑癌基因發揮作用的活性分子結構，還可以通過對hTERT的調控而激活端粒酶活性[15]。有實驗表明被HPV轉染的上皮細胞內端粒的長度停止縮短并不斷增長，使細胞增殖失控達到永生化[16]。

1.4 原癌基因與抑癌基因

真核細胞內存在眾多原癌基因如c-myc、vsrc、c-Jun等可以通過編碼活性蛋白分子來調控細胞增殖分裂分化等生理過程，其中c-myc是最早被發現的原癌基因，有許多與瘤化相關的功能區域，其轉錄表達的蛋白可以通過核膜進入細胞核與端粒酶逆轉錄酶的啟動子結合位點特異性結合，誘導端粒酶mRNA快速表達，直接激活端粒酶活性，促進細胞進入永生化進程[17]。

真核細胞內在細胞永生化的過程中，存在多種抑癌基因如p53、pRb、BRCA1、DPC4等，通過等位基因隱性作用、抑癌基因的顯性負作用等逐漸失去活性，細胞老化途徑受到阻止。有實驗證明端粒酶的活性與抑癌基因表達產物的下調有相關關系，推測抑癌基因的失活協同端粒酶的激活共同參與細胞永生化的進程[18]。

2 不同細胞永生化的方法及機制

雖然永生化的機制有相似之處，但同樣的永生化方法并非適用于所有細胞，因此，有針對性地發展對特定細胞的永生化技術可以幫助傳代次數少、增殖分裂慢的細胞增加細胞周期壽命，達到臨床要求的治療功效。

2.1 肝細胞永生化方法

由于先天性肝臟疾病和肝衰竭等肝疾病發病率增高、捐贈供體短缺，使得體外活性肝臟的臨床價值越來越高。雖然肝臟代償功能強大，體內處于分裂休眠期的肝細胞數量巨大，但由于肝細胞生長分裂與自身三維立體結構及內部微環境緊密相關，肝細胞體外培養難度高、成功率低、傳代困難，因此對外源性永生化肝細胞的研究是如今臨床研究的重點。

2.1.1抑癌基因敲除 鑒于抑癌基因對細胞周期的控制和誘導細胞衰老的機制，有實驗證明經過抑癌基因如p53等敲除后的體外肝細胞可以突破正常的細胞周期生長抑制極限，進入到無限增殖的狀態。永生化肝細胞進行特異性分化、基因表達和表型與體內肝細胞基本相同。這種實驗思路在小鼠肝細胞實踐中已經獲得了成功的實驗案例，基因敲除的外源性培養肝臟移植到小鼠體內可以定植生長，但是基因缺失的細胞介于正常細胞與癌細胞狀態之間，其瘤化幾率以及基因穩定性問題還未得到圓滿解決[19]。

2.1.2質粒轉導和病毒轉染 鑒于端粒-端粒酶學說對細胞永生化的可行性，用多順反子質粒載體以及逆轉錄病毒將hTERT基因導入正常肝臟細胞核內，使端粒酶逆轉錄酶基因整合到肝細胞基因內并穩定表達，經過特定的細胞培養環境可以得到端粒長度增加，細胞壽命增長的正常人源肝細胞，可以傳代300代以上并且沒有致瘤性，其表達產物如肝藥酶、細胞色素、白蛋白等均與內源性肝細胞產物相同[20]。但是目的基因以外的病毒外源性基因對細胞正常生理功能的潛在影響問題還有待解決。

2.1.3可恢復性永生化 目前為了解決外源性基因以及病毒內靶基因意外無關序列對細胞的影響，提出了可恢復性永生化的思路，即導入永生化基因后在細胞增殖穩定表達出正常細胞產物后，在合適的細胞周期區間，使用特異性整合技術敲除導入的目的基因，使細胞初始化。有實驗表明，在敲除永生化相關基因后，本該停止繼續增殖的現象并未發生，反而細胞在特異性分化、分泌代謝等方面趨向成熟，并且在端粒長度、基因完整性等方面與內源性肝細胞極其相似[21]。

2.2 上皮細胞永生化方法

DNA致瘤病毒轉染是目前上皮細胞永生化最常用的方法。HPV重要的轉化蛋白是E6，將HPV導入上皮細胞中，E6表達的產物可以與p53蛋白相結合并通過細胞內水解酶將p53降解[22]。E6可以單獨作用于細胞基因使端粒酶活性上升，加速端粒的自我復制。病毒轉染對口腔上皮細胞、視網膜上皮細胞、胰腺上皮細胞等永生化研究已經取得一定進展，但是角化上皮細胞等細胞在病毒轉染基礎上還需要其他因子共同作用。

2.3 心肌細胞永生化方法

隨著心肌梗死等心血管疾病的發病人數穩步攀升，心臟衰竭終末期的唯一治療方法就是心臟移植，因此自體心肌細胞體外永生化培養具有很高的臨床價值。

目前有實驗通過P16慢病毒載體和可逆SV40病毒轉導途徑成功建立了永生化心肌祖細胞。用心肌細胞譜系標志作為評價標準來觀察轉導細胞的生長狀態，發現轉導后細胞不僅可以成功增殖分裂，抑制衰老周期，還具備心肌干細胞的分化潛能。也有實驗表明心肌成纖維細胞經過HPV病毒轉染后成功增加壽命，并正常表達與初級成纖維細胞相同的細胞特異性標志物、細胞因子等[15]。雖然特定心肌細胞株永生化具有巨大研發空間，但是由于心肌分化是一個涉及眾多微環境因素的復雜過程，因此重建永生化心臟還存在許多困難。

2.4 胚胎滋養層細胞永生化方法

胚胎滋養層細胞對胚胎發育具有重要作用，建立體外永生化滋養層細胞株對建立分泌細胞模型、研究胚胎疾病毒理以及腫瘤的發生發展都有很大的臨床價值。已有研究成功將HPV中E6和E7與端粒酶逆轉錄酶相結合建立表達載體導入山羊滋養層細胞，培養出的胚胎滋養層細胞不僅表現出較高的端粒酶活性，并且對hTERT基因表達非常穩定、無致瘤性，最高可以傳代50代以上[23]。細胞具有初級滋養層細胞的一切形態功能，檢測到金屬基質蛋白酶(MMP-2)、絨毛膜促性腺激素、免疫因子等滋養層細胞特異性分泌因子，符合長壽命體外細胞模型的觀察標準[24]。

目前還有研究發現，在母嬰垂直傳播乙型肝炎病毒(HBV)案例的母體中發現可自發永生化滋養細胞系HPT-8。推測這種自發永生化的細胞是宮內感染過程中HBV整合在滋養層細胞內與正常基因相互作用并穩定表達的結果。對HPT-8進行電鏡觀察、免疫組化和細胞學熒光分析顯示，細胞的形態以及細胞內容物特征與正常細胞極其相似，并且發現滋養層細胞特有的胞間橋粒以及細胞角蛋白、堿性磷酸酶、各種特異性激素等細胞標志物。同時，HPT-8細胞表面也發現了HBV抗原[25]。這種病毒與滋養層細胞融合后表達的克隆衍生物提示病毒適當表達可以促進細胞的永生化進程。

另外，還有其他多種細胞也已成功培養出永生化細胞株如：B淋巴細胞在體外用EB病毒轉染后培養出可以穩定表達IgG的細胞株；用SV40慢病毒轉染人臍靜脈內皮細胞獲得與正常細胞形態學，特征性標志物無明顯差別的永生化細胞株等。

3 展 望

細胞永生化是細胞研究的一個重要方向，通過對細胞永生化的研究，不僅有助于進一步了解細胞生長規律，探索細胞衰老原因，而且對明確腫瘤發生機制、促進解決器官移植問題有著重要意義。但細胞永生化的研究仍存在一些問題，如將病毒導入目的細胞后可能產生有害細胞產物，導致細胞安全性存在隱患；由于永生化細胞是體細胞向癌細胞過度的一種中間狀態細胞，涉及癌基因的表達，其在體內的安全性也受到質疑。即使現在對肝細胞、心肌細胞等永生化研究已經有很大進步，但往往成本較高，成功率低，且對永生化心肌細胞等特定細胞的分化仍十分困難。如何開發出成本較低、安全性好且功能正常的永生化細胞也是重要的研究方向。

永生化胚胎滋養層細胞作為現代細胞工程學研究的新焦點，對探索胚胎疾病、建立體外細胞模型、明確腫瘤發生和細胞衰老機制有著極大的臨床價值，但同時胚胎細胞的永生化也涉及倫理道德方面的問題，需要注意。

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2015-05-02

2015-06-01

國家自然科學基金青年基金資助項目(31200730)

黃今(1993-)，女，遼寧沈陽人，在讀碩士研究生。E-mail：632891329@qq.com

馬海英 E-mail：1090955300@qq.com

黃今，楊融輝，馬海英.細胞永生化機制及不同細胞永生化方法研究進展[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：821-824．

R329.2

A

1671-6264(2015)05-0821-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.031