原位膀胱癌動物模型建立的研究進展及應用展望

付陽，熊軼，張古田

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.南京鼓樓醫院 泌尿外科，江蘇 南京 210008)

·綜 述·

原位膀胱癌動物模型建立的研究進展及應用展望

付陽1，熊軼1，張古田2

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.南京鼓樓醫院 泌尿外科，江蘇 南京 210008)

建立原位膀胱癌動物模型的方法很多，最早使用化學誘癌劑致癌，目前最常使用細胞或組織原位移植技術，基因工程技術尚不成熟。深刻理解動物模型建立的方法有助于探究膀胱癌發生發展的分子機制及更好地評價新型靶向藥物的功效。作者對常用的建立原位膀胱癌動物模型的具體方法步驟、各自特點作一綜述并展望其應用。

動物模型； 膀胱癌； 研究進展； 展望； 文獻綜述

膀胱癌是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發病率及病死率均列泌尿生殖系統腫瘤的首位[1]。表淺性的膀胱癌，首選經尿道膀胱腫瘤電切術(TURBT)治療輔助術后膀胱灌注化療藥物。由于新發腫瘤、腫瘤細胞種植于手術創面或者原發腫瘤切除不完全，TURBT術后腫瘤復發率居高不下，因此迫切需要開發新型的術后輔助治療方法。早期的腫瘤研究多采用體外細胞實驗，但其具有相當的局限性，比如腫瘤細胞生長的環境異于原位腫瘤、缺少腫瘤生長及發展的多向性、缺少血管化及血管灌流、缺少免疫反應的干預、培養基多包含人工的生長因子和激素。動物實驗是細胞實驗和臨床實驗之間的重要橋梁，在特定條件下，動物疾病的發生發展與人類相似，且動物擁有與人類相似的解剖、生理及遺傳，因此動物模型常被用來研究人類疾病。原位膀胱癌的動物模型可用來研究人類膀胱癌疾病的病因、病理改變及相關生物學行為，也是進行新型抗膀胱癌藥物、給藥方式實驗的基礎。

1 化學致癌劑誘導模型

1944年有研究[2]首次報道使用二乙基氨基芴(AAF)成功誘導鼠的膀胱乳頭狀瘤模型。AAF是一個多能致癌物，也可以誘導其他器官的腫瘤，包括肝臟、胰腺、乳腺、皮膚等。以后發現許多化學物質可以成功誘導實驗動物的原位膀胱癌模型。但因為誘導腫瘤的周期過長、腫瘤誘發率過低、本身毒性作用太強及器官特異性較差等因素，大部分化學致癌劑的效果并不能使人滿意，這限制了該種方法的廣泛使用。目前效果理想的致癌劑仍只有N-methyl-N-nitrosourea(MNU)、N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine(BBN)等亞硝基類化合物和N-[4-(5-nitro-2-furyl)-2-thiazolyl] formamide(FANFT)等硝基呋喃類化合物兩大類。

1.1 膀胱灌注MNU誘導原位膀胱癌模型

MNU為直接誘癌劑，在動物體內主要通過細胞大分子比如鳥嘌呤等發生甲基化作用，可以對很多臟器產生致癌活性，并且呈現出漸進的致癌動態過程。Hicks等于1972年首次報道分次膀胱灌注MNU溶液可以快速誘導大鼠的原位膀胱腫瘤[3]，此后國內外建立原位膀胱癌模型大多采用多次定量膀胱灌注MNU溶液的方法[4-5]。各種規格的MUN可以由醫藥公司直接購得，劉紅耀等[6]曾使用甲胺、尿素、亞硝酸鈉及濃酸等化學試劑自制MNU并成功誘導大鼠原位膀胱癌模型；配制溶液的溶劑多選用pH 6.0的緩沖液，在此pH值下MNU的半衰期最長，可使其作用于膀胱時間最大化以增強誘發膀胱癌的效果；實驗動物一般選用6～10周雌性大鼠，由于其生理解剖特點，方便經尿道插入導管進入膀胱并灌注MNU溶液；導尿器材采用長約5 cm的硬膜外導管即可；采用膀胱灌注MUN建模，用量多為每次2 mg或2.5 mg，每兩周1次，灌注2～4次，開始膀胱灌注后7周，病理檢查即出現原位膀胱癌改變，9周左右其致癌率可達100%[7]；研究表明,分次定量灌注MUN，其誘癌率與灌注MNU總量及膀胱灌注次數呈正相關，誘癌需時與膀胱灌注MNU 的總量呈負相關。該方法特點主要有：(1) 膀胱灌注MUN用量相對偏少且比口服給藥精確；(2) 操作相對方便，只需行膀胱灌注數次便可誘導原位膀胱癌，用時相對短；(3) 其誘導的原位膀胱癌與人類膀胱癌的發生、發展及生物學行為相似，病理學上多為尿路上皮癌；(4) 加用表皮生長因子、菲那西丁、糖精等促癌劑可明顯縮短誘癌時間；(5) 聯合應用BBN等其他誘癌劑可明顯增強MNU的誘癌活性；(6) MNU的本身毒性容易導致實驗動物的死亡，實驗過程的死亡率可達10%～40%。

1.2 經口給藥BBN或FANFT誘導原位膀胱癌模型

BBN及FANFT均屬間接誘癌劑，BBN多數混入飲水、FANFT常混入日常飲食給藥。目前BBN是誘導動物膀胱癌最常使用的化學致癌劑，因為其誘癌效應具有膀胱特異性,可能是研究中最常應用的實驗誘癌劑。BBN主要通過激活體內酶系統而發揮致癌作用，可導致組織結構和生理功能的變化，其致癌作用具有器官特異性，因為其自身及其進一步代謝產物N-butyl-N-(3-caroxypropyl，BCPN)經尿液排出，直接與尿路上皮接觸，導致其發生炎癥和壞死，造成尿路上皮細胞DNA損傷，從而導致尿路上皮細胞發生癌變[8]。BBN致癌的實驗動物品種很有限，僅限于大鼠、狗及小鼠，其中大鼠的膀胱上皮對BBN最敏感；實驗中BBN的給藥方式多采用管飼灌胃法，此法簡單、可靠、精確、安全，也可將BBN溶于飲水中飼養實驗動物，常用濃度為0.01%～0.05%[9]；部分研究報道也可采用皮下注射、膀胱灌注方法；給藥劑量多為每千克50～100 mg；研究表明與大劑量集中給藥相比，小劑量多次給藥的誘瘤率高、平均瘤體積大、細胞分化差、數目多、浸潤率高。FANFT在體內主要通過膀胱黏膜的前列腺素H合酶共氧化作用發揮致癌效應；其致癌譜較廣，常用于誘導多種動物的膀胱癌模型，嚙齒類對其較敏感；給藥方式多為混入食物中飼喂實驗動物，常用濃度為0.2%[10]；試驗中FANFT致癌花費較多，誘癌時間也長。

不管采用何種誘癌劑誘導膀胱癌，膀胱癌變均需經歷一個續發的動態改變過程，且因動物品系不同而稍有變化。肉眼觀察，在膀胱癌的發生過程中，可以見到大小不一的灰白色腫物隨機分布于整個膀胱腔內任意處，甚至可以多發至布滿膀胱腔內；大鼠膀胱癌可表現為與人類病變相似的帶蒂的菜花樣腫物，伴區域壞死、出血、潰瘍等。小鼠膀胱癌鏡下常顯示經歷上皮異型增生、原位癌、浸潤性癌的過程；而大鼠則為單純性增生、發展為乳頭狀或結節性增生、乳頭瘤、低度惡性的乳頭狀瘤、低級別乳頭狀癌、高級別乳頭狀癌和浸潤性癌的動態過程。相比于小鼠，大鼠膀胱腫瘤更易表現為乳頭狀癌。這提醒我們研究中不僅需要選擇誘癌方式，也需要根據誘癌要求選擇合適的動物品系。

2 基因工程模型

目前除采用化學試劑誘導原位膀胱癌動物模型，已有研究開始使用轉基因動物來建立膀胱癌動物模型。當前已被研究證實的膀胱癌的相關基因主要有RB1、Ha-ras、CK19-Tag、Nrf2、P53、Pten、Hras 128、p27和UPⅡ-SV407；膀胱上皮的致癌基因Ha-ras等的激活或抑癌基因RB1和p53的沉默甚至修改考慮與膀胱尿路上皮癌的發生相關[11-12]。隨著膀胱癌相關分子機制的逐漸明了和分子生物學技術的逐漸成熟，人們成功建立了轉基因動物模型，其可以更好地在分子水平再現人類膀胱癌的生物學行為。建立轉基因動物模型的方法主要包括顯微注射法、精子載體法、逆轉錄病毒感染法和胚胎干細胞介導法，其中以顯微注射法最為成熟。將純化的目的基因片段顯微鏡下注射入受精卵，該目的基因片段可整合至實驗動物染色體中，隨著胚胎發育而分布于實驗對象每一個體細胞中，建立膀胱原位癌模型的基礎是該目的基因可以特異性表達于不同組織和器官。一項研究表明，缺乏pRB和p53表達的小鼠極易受到致癌物質的影響，并最終表現出與人類膀胱癌相似的膀胱浸潤性癌[13]。轉基因動物模型提供了一個研究膀胱癌癌變過程分子機制及評價潛在新藥和治療方式的理想體系，但其有技術復雜，費用高昂、基因外顯率低、建模成功率低、缺少預測腫瘤發展的標準模式等問題，利用外源癌基因或其相關激活基因轉染建立模型會簡化操作步驟，因此利用基因轉染技術來建立原位膀胱癌模型成為新的研究熱點；特定基因的敲除、沉默或者置換可以研究該基因片段在癌變過程中的相關作用。基因工程模型的局限性也是顯而易見的，實驗動物發生的膀胱癌往往較單一，而人類膀胱癌是多樣化的。

3 原位膀胱癌移植模型

膀胱內移植膀胱癌細胞或組織碎片是目前最廣泛采用的原位膀胱癌建模的方法，根據使用的細胞株或組織塊的來源可分為同種移植和異種移植。常用的細胞株有MB49和MBT-2[14]，利用兩種細胞株建立原位膀胱癌模型的成功率可達30%～100%[15]；移植模型建立的成功率與癌細胞預處理的方法、癌細胞數量和分化程度有關。成功研制出免疫缺陷鼠大大提高了異種移植的成功率，該建模方法可以采用人源膀胱癌細胞或者膀胱癌組織來建模，這是化學制劑建模方法無法達到的；但實驗對象先天性的免疫缺陷也導致該移植模型不能進行原位膀胱癌免疫應答的相關實驗研究。移植模型的方便實用及優越性已經得到大家的肯定，目前研究熱點主要集中在怎么改進移植方法以提高建模的成功率。

早期多采用直接向膀胱內灌入膀胱癌細胞或組織碎片的方法，操作步驟與膀胱灌注MNU相似，是經尿道將導管插入實驗對象的膀胱，再向膀胱內灌入膀胱癌單細胞懸液以建立原位膀胱癌的動物模型，解剖學上的差異致使該技術較難在雄性動物上實施，目前實驗室多采用易于操作的雌性動物。異種移植采用的人源膀胱癌細胞有KK47、KU7、T24及UM-UC1等[16-17]。相關研究認為僅僅增加灌入膀胱的腫瘤細胞數量并不增加膀胱內灌注建模的成功率，其成功率還受到懸液的菌體濃度、灌入懸液的體積及懸液與膀胱黏膜接觸時間的影響。有研究表明適當延長灌入懸液于膀胱的停留時間可以提高建模的成功率[18]；有報道對膀胱灌注法加以改進，膀胱灌注膀胱癌單細胞懸液后夾閉導管直至實驗對象清醒，該法可防止麻醉期間灌入實驗對象膀胱的膀胱癌單細胞懸液外流，延長膀胱癌細胞與實驗對象膀胱黏膜的接觸時間，發病率可達100% ，是一種更為方便、簡單、有效的建模方法。

完整膀胱黏膜表面覆蓋著一層氨基葡聚糖，可保護膀胱黏膜免受移植的腫瘤細胞侵襲，降低了建模的成功率。相關研究表明，通過破壞膀胱黏膜完整性可提高建模的成功率；常采用機械損傷、強酸強堿腐蝕作用及高溫高熱破壞膀胱黏膜后再進行膀胱癌細胞或組織的移植。早期大多采用開放手術暴露實驗對象的膀胱，使用注射器將膀胱腫瘤單細胞懸液直接注入黏膜下層完成移植；此法建立的模型腫瘤局限于黏膜下層，減少了發生上尿路感染和膀胱癌細胞的逆行種植的幾率，有術中出血、術后感染和癌細胞種植于手術區域的可能。Yang等[19]報道一種機械損傷后再建模的新方法，其使用靜脈留置針自制成內有彎曲針芯的導管，將該導管經尿道置入膀胱，進入膀胱后慢慢旋轉針芯損傷膀胱黏膜，抽出針芯，從導管末端向膀胱內灌入膀胱腫瘤單細胞懸液以建立模型，誘發膀胱內腫瘤所需時間27 d左右，建立原位癌模型成功率高達100%；該方法不需繁瑣的手術操作，對膀胱損傷較小且易重復，具有很強的實用性。Dobek等自制帶有絕緣導管的鉑絲，經尿道置入膀胱內，使用電流造成膀胱的電熱損傷，再灌入膀胱癌單細胞的懸液并保留至少90 min，允許懸液的自然流失，膀胱成瘤率高達100%且無膀胱穿孔發生；該法簡單、方便、可重復，操作器械要求較高，有膀胱穿孔的可能性[20]。其它的膀胱預處理方法還包括強酸、強堿、胰蛋白酶及多聚賴氨酸等[21-23]；Watanabe[21]等報道首先使用0.1 ml的0.2%濃度胰蛋白酶灌入膀胱并保留30 min，機械性損傷膀胱黏膜后緩慢灌入膀胱腫瘤單細胞懸液且持續3 h；10 d后顯微鏡鏡檢膀胱成瘤率高達90%，但操作有關的死亡率高達30%。該法成瘤迅速、操作簡單方便，但實驗過程中死亡率偏高。

4 原位膀胱癌動物模型用于新型靶向藥物功效評價

過去的幾十年間，大量的研究采用組織病理學、免疫組化、影像分析、基因分析及基因測序分析發現了人類和嚙齒類動物膀胱癌的大量相似之處[24]。Lu及其團隊[25]使用嚙齒類動物膀胱癌模型，發現目標基因與臨床表現的精確對應關系，且研究者還發現這些基因在人類膀胱癌中也是異常表達的。其中CNN1、MYL9、PDLIM3、ITIH5、MYH11、PCP4和FM05是顯著下調表達的，而T0P2A、CCNB2、KIF20A和RRM2則是顯著上調的；這些基因的異變有可能促進膀胱的癌變。基因集合分析發現在人類或者嚙齒類動物的膀胱癌中，一些分子信號通路均處于激活狀態。這些分子信號通路可影響細胞周期、原癌基因、細胞凋亡和細胞自噬等。以往的癌癥療法均是基于采用藥物影響細胞分裂，但這些藥物也會影響到正常細胞的分裂且其或多或少具有一定的毒副作用。現在發現，識別某些信號通路如FGFR3、RAS和PIK3CA等，也可抑制癌細胞增殖及致死腫瘤細胞；最關鍵為這些靶向藥物可以僅僅針對膀胱癌細胞，對正常細胞的影響微乎其微。

總而言之，建立原位膀胱癌動物模型已經有了許多可行、有效、可重復的方法，熟悉各方法的優缺點及適用范圍，可幫助選擇有效、適當的方法完成實驗研究。隨著膀胱癌分子機制的逐漸明確，原位膀胱癌模型也會更多地應用于新型靶向藥物的功效評價。

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2015-04-28

2015-05-12

江蘇省人事廳六大人才高峰項目(2011-WS-007)

付陽(1990-)，男，江蘇淮安人，在讀碩士研究生。E-mail：15952083610@163.com

張古田 E-mail:zgt6810@aliyun.com

付陽，熊軼，張古田.原位膀胱癌動物模型建立的研究進展及應用展望[J].東南大學學報：醫學版，2015，34(5)：832-835．

R-332; R737.14

A

1671-6264(2015)05-0832-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.034