不同提取方法對北五味子多糖提取率的影響

程振玉　宋海燕　楊英杰　劉治剛　張碩

摘要：考察了不同提取方法對北五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill]多糖提取率的影響。分別采用回流法、微波輔助法、閃式法對北五味子多糖進(jìn)行提取，通過可見-分光光度法測定其含量，設(shè)計響應(yīng)面試驗對其最佳方法的工藝進(jìn)行優(yōu)化。閃式法多糖提取率高于回流法和微波輔助法，其最佳工藝為料液比1∶20（m∶V），提取時間127 s、提取電壓190 V、提取溫度78 ℃，在此條件下北五味子多糖的提取率達(dá)到20.97%。不同提取方法對多糖的提取率影響較大，閃式法多糖提取率高，耗費時間短，溶劑用量少。

關(guān)鍵詞：北五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill]；多糖；回流法；微波輔助法；閃式法

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0159-05

北五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill]是五味子科植物五味子的干燥成熟果實，主產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古等地[1]。五味子是著名的滋補性中藥，具有收斂固澀、益氣生精、補腎寧心的功效[2，3]。現(xiàn)代藥理研究表明，北五味子多糖是其主要活性成分之一，具有提高機體免疫力、保肝、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞等生理活性[4，5]。因此，研究北五味子多糖的最佳提取工藝，對新藥和功能性食品的開發(fā)具有重要的學(xué)術(shù)意義和利用價值。

北五味子多糖的傳統(tǒng)提取多采用回流法，提取時間長，通常需要數(shù)小時，且溶劑耗費量大。近年來，微波輔助法[6，7]、閃式法[8，9]等新技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然藥物的提取，這些方法具有時間短、溶劑用量小、提取率高、簡單易行等特點，但鮮見關(guān)于采用閃式法提取北五味子多糖的報道，本試驗采用上述3種方法同時進(jìn)行研究，優(yōu)選北五味子多糖的最佳提取方法及其工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)北五味子多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

北五味子購買于吉林省通化市，產(chǎn)地為長白山，經(jīng)過吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院隋新教授鑒定為北五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill.]的干燥果實。所用試劑均為分析純。所用儀器有：722型可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司），XH-100A型微波合成/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司），JHBE-50S型閃式提取器（河南金鼎科技發(fā)展有限公司），RT-08型多功能粉粹機（榮聰精密科技有限公司），RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SHZ-D型循環(huán)水式真空泵（河南省鞏義市英峪儀器一廠）。

1.2 多糖含量的測定

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法[6，10]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱量105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品100.00 mg，加去離子水溶解、搖勻，定容到100 mL，制成1.00 mg/mL貯備液，取出25 mL上述貯備液置于250 mL容量瓶中，制成0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別精確量取上述溶液5、10、15、20、25、30、35 mL，置于7個50 mL容量瓶中，加去離子水搖勻定容。分別取1 mL，置于7個25 mL的具塞比色管中，加入新制成5%的苯酚溶液1.0 mL，再迅速加入5 mL濃硫酸，充分搖勻，另取1 mL去離子水做空白對照。于25 ℃放置30 min，在490 nm處測定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 多糖含量的測定 精確稱量精制干燥的北五味子多糖50 mg，用去離子水溶解后定容到100 mL，制成0.50 mg/mL溶液，取出4 mL上述溶液置于25 mL容量瓶中，制成80 μg/mL的多糖貯備液，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度值[11-13]。按以下公式計算換算因子：

f=W/CD

式中，W為多糖質(zhì)量（μg）；D為多糖的稀釋因子；C為多糖溶液中葡萄糖的濃度（μg/mL）。測得換算因子f為1.76。根據(jù)該因子計算多糖質(zhì)量。

多糖含量=多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%

1.3 北五味子多糖的提取

1.3.1 回流法 將北五味子粉碎，過孔徑不同的篩子， 于60 ℃烘干至恒重，精確稱取10.0 g，平行稱量3份。根據(jù)試驗設(shè)計，按照一定的料液比（m∶V，g/mL，下同）加入去離子水，在一定的溫度下回流提取一段時間。提取液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，抽濾，藥渣重新加入適量去離子水洗滌，重復(fù)上述提取液的離心操作2次，合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的1/5，加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置，冷凍過夜。抽濾，沉淀經(jīng)無水乙醇洗滌數(shù)次，干燥，得到北五味子粗多糖。

1.3.2 微波輔助法 與“1.3.1”相同方法處理，根據(jù)試驗設(shè)計，加入一定量的去離子水，在一定的溫度下以一定功率的微波輻射萃取一段時間，提取液按照上述方法操作，得到北五味子粗多糖。

1.3.3 閃式法 與“1.3.1”相同方法處理，根據(jù)試驗設(shè)計，按照一定的料液比加入一定溫度的去離子水，在一定的電壓下提取一段的時間，提取液按照上述方法操作，得到北五味子粗多糖。

1.4 閃式法提取北五味子多糖響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在上述3種方法提取北五味子多糖的單因素試驗的基礎(chǔ)上，對多糖提取率最高的閃式法進(jìn)行工藝優(yōu)化。根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，對多糖提取率影響比較顯著的3個因素提取溫度、提取電壓、提取時間用響應(yīng)面試驗設(shè)計法進(jìn)行優(yōu)化，試驗因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程見圖1。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.009 9x-0.017 9，R2=0.999 7，在10～70 μg/mL范圍內(nèi)葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，可用于多糖含量的準(zhǔn)確分析。endprint

2.2 回流法提取北五味子多糖單因素試驗結(jié)果

由圖2可知，北五味子超過60目以后，藥材粒徑對多糖的提取率影響很小，多糖提取率沒有明顯變化。但目數(shù)越大，過篩難度增加，且不利于后續(xù)抽濾等操作。因此，選擇60目作為粒徑的最佳水平。在4 h之前，北五味子多糖提取率隨著時間的延長而增加，這可能是因為細(xì)胞的破碎程度隨溫度升高而增加，故水溶性北五味子多糖溶出量也變大[14]。但4 h之后，提取率反而有降低的趨勢，這可能是由于長時間的高溫提取，造成了糖鏈的降解，因此選擇最佳提取時間為4 h。

由圖2可知，提取溫度從40 ℃上升到 60 ℃，北五味子多糖提取率緩慢增加，從60 ℃到100 ℃多糖提取率急劇增加，100 ℃時該提取率超過了60 ℃的2倍，因此選擇100 ℃作為最佳提取溫度。當(dāng)料液比由1∶10增加到1∶40時，北五味子多糖的提取率隨著溶劑的增加逐漸升高，但繼續(xù)增加溶劑，多糖提取率呈下降趨勢，這可能是由于雜質(zhì)的析出量也增多，抑制了目標(biāo)成分的析出。因此選擇1∶40作為料液比的最佳水平。

綜合以上結(jié)果可知，回流法提取北五味子多糖的最佳工藝條件為藥材粉碎過60目篩、料液比1∶40、提取溫度100 ℃、提取時間4 h。

2.3 微波輔助法提取北五味子多糖單因素試驗結(jié)果

由圖3可以看出，粒徑對北五味子多糖的提取效果影響較大，隨著藥材粒徑的增大，多糖提取率逐漸提高，但超過80目時，多糖的提取率呈逐漸下降的趨勢，因此選擇80目作為藥材的最佳粒徑。隨著料液比逐漸增大，多糖提取率明顯升高，但當(dāng)料液比超過1∶10時，多糖的提取率出現(xiàn)拐點，呈下降趨勢，因此選擇1∶10作為料液比的最佳值。

由圖3可以看出，北五味子多糖的提取率隨著溫度的升高緩慢增加，溫度從80 ℃到100 ℃時，北五味子多糖的提取率急劇增加，因此選擇100 ℃作為最佳提取溫度。隨著提取時間的延長，多糖的提取率逐漸提高，但40 min后，多糖提取率趨于穩(wěn)定，因此選擇40 min 作為最佳提取時間。當(dāng)微波功率低于700 W時，北五味子多糖提取率隨著微波功率的增加逐漸升高，700 W以后呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢，從節(jié)約能源和保護(hù)設(shè)備的角度出發(fā)，選擇700 W作為最佳功率。

綜合以上結(jié)果可知，微波輔助法提取北五味子多糖的最佳工藝條件為藥材粒徑80目、料液比1∶10、微波功率700 W、提取時間40 min。

2.4 閃式法提取北五味子多糖單因素試驗結(jié)果

由圖4可以看出，料液比由1∶5增長到1∶20時，北五味子多糖提取率明顯升高。但超過1∶20以后，多糖提取率反而呈下降的趨勢，這可能是因為提取溶劑過多，藥材與刀頭的剪切幾率下降，導(dǎo)致活性成分不能被充分提取。因此，應(yīng)該謹(jǐn)慎考慮閃式提取法中溶劑的量，選擇1∶20作為料液比的最佳值。當(dāng)溫度低于80 ℃時，北五味子多糖的提取率隨著溫度的增加急劇升高，80 ℃以后多糖提取率沒有明顯變化。考慮到溫度太高可能會對多糖高級結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響，選擇70～90 ℃進(jìn)一步做優(yōu)化試驗。

閃式提取器最核心的優(yōu)勢就是集粉碎、浸泡、攪拌和振動等技術(shù)優(yōu)勢于一體，使其活性物質(zhì)的提取速度快，完成一次提取僅需要幾十秒到幾分鐘[15]。由圖4可知，提取時間達(dá)到90 s時提取率變化不明顯，表明多糖已基本提取完全，因此選擇90～150 s進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)提取電壓低于160 V時，多糖的提取率隨著電壓的增加逐漸升高，超過160 V以后，多糖的提取率稍有降低。從保護(hù)電機的角度綜合考慮，選擇130～190 V電壓進(jìn)行優(yōu)化。

2.5 閃式法提取北五味子多糖響應(yīng)面結(jié)果分析

2.5.1 模型的建立及顯著性檢驗 利用Design-Expert 8.0軟件對響應(yīng)面試驗結(jié)果（表2）進(jìn)行二次多項式逐步回歸擬合，得到方程為Y=18.56-1.00A+3.38B+0.80C+0.096AB+0.067AC+0.43BC-2.08A2-0.32B2-2.72C2。

模型的可靠性可由方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察。由表3可知，該模型的F=50.28，P<0.000 1，證明該試驗所選用的二次多項模型極顯著。在總的作用因素中，A、B、C、A2、C2項（P<0.01）對多糖的提取率有極顯著的影響；交互項AB、AC、BC對多糖的提取效果影響不顯著，表明各因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，其交互作用影響不顯著，可忽略[16]。失擬項P=0.870 7>0.05，無顯著性影響，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點，模型適當(dāng)，不需要引入更高次數(shù)的項；回歸方程的R2=98.48%，表明本試驗只有1.52%的數(shù)據(jù)不能用該模型來解釋，R2=98.48%與R2adj=96.52%極為相近，說明回歸方程擬合度很高，該模型能很好地描述試驗結(jié)果，可以用來準(zhǔn)確分析和預(yù)測閃式法提取北五味子多糖的結(jié)果。

2.5.2 提取工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 為了更直觀地表現(xiàn)2個因素對北五味子多糖提取率的影響，可以設(shè)其他因素水平值為0，把提取溫度、提取電壓、提取時間3個因素中一個因素取0水平，選擇另2個因素對多糖提取率的影響進(jìn)行分析，圖5直觀地反映了因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響。

由圖5可知，本試驗所探究的因素（提取電壓、提取時間、提取溫度）對北五味子多糖的提取率影響均極顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。隨著提取電壓、提取溫度、提取時間中任何一個因素的變化，響應(yīng)值變化均較大；尤其是隨著提取電壓的變化，多糖提取率發(fā)生明顯的變化，響應(yīng)值變化較大。由Design-Expert 8.0軟件對試驗參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，可以得出最優(yōu)條件為提取溫度77.86 ℃，提取電壓190 V，提取時間126.7 s，此時的北五味子多糖提取率可達(dá)21.85%。

2.6 最佳試驗條件的驗證

考慮到實際操作的可行性，將北五味子多糖提取的最佳工藝條件調(diào)整為提取溫度78 ℃、提取電壓190 V、提取時間127 s。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗，多糖提取率的平均值達(dá)到20.97%，與理論預(yù)測值基本相近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實用價值。endprint

2.7 不同提取方法北五味子多糖提取率的比較

根據(jù)上述研究結(jié)果，在每種方法的最佳工藝下進(jìn)行3次試驗，取平均值作為北五味子多糖的提取率。結(jié)果表明，回流法多糖提取率（15.39%）含量最低，微波輔助法與閃式法提取率分別為17.56%、20.97%。閃式提取法多糖提取率最高，且需要時間最短（5 min內(nèi)就完成提取），其消耗的時間為微波的1/8。因此，閃式提取法不僅減少了能源的消耗，且明顯提高了北五味子多糖的提取率。

3 小結(jié)

閃式法作為一種新型的提取工藝，因其具有操作簡單、需要時間少、提取率高等特點已經(jīng)在多種植物活性成分的提取中得到了廣泛應(yīng)用。本試驗采用這一技術(shù)實現(xiàn)了北五味子多糖的高效提取，在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定了閃式法提取北五味子多糖的最佳工藝為料液比1∶20，提取溫度78 ℃，在190 V的電壓下提取127 s，提取2次。在此優(yōu)化條件下，北五味子多糖的提取率達(dá)到20.97%，與回流法和微波輔助法相比，不僅提取時間大大減少，且提取率明顯提高。表明閃式提取技術(shù)操作簡便，溶劑用量小，提取時間短，能耗低，效率高，為工業(yè)化大量生產(chǎn)北五味子多糖提供了參考。

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