黃芪多糖純化和硫酸酯化及紅外光譜分析

杜晉平　賈陳忠　薛翼鵬　張文杰　李宏全

摘要：以黃芪多糖粗提物為樣品，采用蒽酮-濃硫酸比色法測定其多糖含量，并利用聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱進行純化，采用不同洗脫劑洗脫；用氯磺酸-吡啶法對黃芪多糖進行硫酸酯化；紅外光譜分析黃芪多糖粗提物、純化樣及硫酸酯樣品，研究黃芪多糖粗提物的純化和硫酸化并對其紅外光譜進行分析。結果表明，聚酰胺柱或AB-8大孔樹脂柱對黃芪多糖進行純化，使用去離子水或30%以下的乙醇作為洗脫劑均可取得較好的效果；氯磺酸-吡啶法可以對黃芪多糖進行硫酸酯化。

關鍵詞：黃芪多糖；柱純化；硫酸酯化修飾；紅外光譜

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0154-05

藥用黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus mongholicus Bunge）或膜莢黃芪（A.membranceus Bunge）的干燥根，其味甘，性微涼，具有補氣升陽、益衛固表、利尿脫毒等功效[1]。黃芪多糖（Astragalus polysacharides，APS）是黃芪中重要的天然有效成分，是黃芪藥理作用中起決定性因素的一類大分子化合物，具有促進抗體生成、抗菌、抗病毒、防衰老及調節血糖等作用[2]，廣泛應用于中醫臨床及動物免疫增效劑[3]，對黃芪多糖的研究引起了人們極大的關注。

黃芪中所含化學成分較多，包括多糖、甙類、氨基酸、黃酮和微量元素等[4]。不同來源的黃芪原料（即使是相同黃芪原料），提取和分離過程的差異都可能造成產物的不同。為了有效探討黃芪中多糖的作用效果，需要純度較高的黃芪多糖來進行研究，前人對黃芪多糖的提取和純化工藝進行了諸多研究[5，6]。

研究表明，一些天然多糖經過硫酸酯化得到了用途更為廣泛的多糖衍生物[7]。多糖經過硫酸酯化修飾后，除了能獲得抗病毒活性外，還可產生其他生物學活性[8]。利用硫酸酯化這種修飾方式來增加多糖的生理活性已經成為當前開發藥品和保健功能食品的重要手段之一[9]。本試驗利用紅外光譜法對黃芪多糖硫酸酯化前后的光譜圖進行比較，以期通過多糖硫酸酯鍵的特征吸收峰，得到多糖硫酸酯化的位置，為硫酸酯化修飾的黃芪多糖結構和功能間的關系提供依據。在借鑒前人研究的基礎上，對黃芪多糖粗提品進行不同純化方法的比較，為黃芪多糖功能的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪提取物，購自陜西永源生物技術有限公司，由豆科植物蒙古黃芪的干燥根提取，編號YYS-015，規格為黃芪多糖≥50%，棕黃色細粉末。

1.2 主要試劑

葡萄糖（AR）、葡聚糖（AR）、無水乙醇（AR）、蒽酮（CP）、濃硫酸（CP）、鋁粉、碳酸氫鈉（AR）、聚酰胺樹脂和AB-8大孔樹脂（勁凱樹脂有限公司，武漢）。

1.3 主要儀器

紫外分光光度計（UV755B型，上海精密科學儀器有限公司）、控溫攪拌水浴鍋（DK-8D型，金壇市醫療儀器廠）、冷凍干燥器（LGJ型，武漢玉立奧博科技發展有限公司）、紅外光譜儀（NicolET 6700型，賽默飛世爾科技公司）、透析袋（45-1000型，上海綠鳥科技發展有限公司）等。

1.4 測定方法

1.4.1 黃芪多糖粗提樣品中多糖含量的測定

1）對照溶液配制：精確稱取葡萄糖和葡聚糖各10 mg，用去離子水溶解定容至100 mL，其濃度為0.1 mg/mL。

2）標準曲線繪制和回歸方程計算：分別精確量取葡萄糖或葡聚糖對照溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，按楊莉等[6]介紹的蒽酮-濃硫酸比色法操作，顯色60 min后，于625 nm處測吸光度值A，以A為縱坐標，溶液中對照的量W（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，并進行多項式預測回歸，得到葡萄糖回歸方程為A=28.63W2+6.434W，R2=0.991 9，葡聚糖回歸方程為A=23.08W2+2.812W，R2=0.997 1。

3）樣品中多糖含量的測定：精確稱取20～30 mg干燥（65 ℃）的多糖粗提樣品，加去離子水100 mL，過濾，收集濾液。取濾液0.5 mL，按上述的蒽酮-濃硫酸比色法操作顯色后，于625 nm處測定吸光度值，由標準曲線查出樣品的多糖含量，或者由回歸方程計算樣品中黃芪多糖的含量。

1.4.2 黃芪多糖工藝的純化

1）聚酰胺樹脂柱（簡稱聚酰胺柱，下同）預處理。取聚酰胺以90%～95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3～4倍體積的90%～95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣（或極少殘渣）。再依次用2.0～2.5倍體積5%NaOH水溶液、1倍體積的去離子水、2.0～2.5倍體積的10%醋酸水溶液洗脫，最后用去離子水洗脫至pH中性，備用。

參照王淑萍等[2]的方法進行工藝純化。稱取1.0 g黃芪多糖粗提樣品，用去離子水溶解，上處理好的聚酰胺柱（柱體積為100 mL），上柱流速2 mL/min，吸附12 h，分別用200 mL去離子水、10%、30%、50%和70%的乙醇洗脫，洗脫流速2 mL/min。洗脫液蒸干、稱重。洗脫物加水溶解分別定容在250 mL容量瓶中。分別吸取上述溶液0.2 mL于10 mL容量瓶，按“1.4.1”配制標準曲線的方法處理樣品，在625 nm處測定吸光度值。

2）用AB-8大孔樹脂柱替換聚酰胺柱，其他操作一樣，進行黃芪多糖純化工藝的研究。

1.4.3 黃芪多糖硫酸化及凍干粉制備 采用氯磺酸-吡啶法[7]。將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置于冰水中，加入吡啶25 mL，攪拌使之充分冷卻。用滴液漏斗緩慢加入氯磺酸2.5 mL，約30 min滴加完畢，燒瓶中出現大量淡黃色固體（需在通風櫥中進行，小心氯磺酸加入后噴濺）。然后加入黃芪多糖粗提樣品0.4 g（65 ℃預干燥），迅速將三頸燒瓶移入沸水浴中，恒溫攪拌1 h左右，冷至室溫。將反應液加入約3倍體積的無水乙醇靜置沉淀24 h以上，析出沉淀。沉淀溶于去離子水，裝入透析袋，自來水透析48 h，去離子水透析24 h，透析中每3 h左右換水1次。過濾，濾液凍干得到黃芪多糖硫酸酯（Astragalus polysacharin sulfate， APSS）。endprint

1.4.4 紅外光譜檢測 將黃芪多糖粗提樣、純化樣、硫酸酯樣凍干至無水的粉末狀態，在紅外光譜儀上利用反射法在4 000～4 00 cm-1范圍內掃描測定紅外光譜。

1.5 統計分析

采用t-test對以葡萄糖和葡聚糖為標準的黃芪多糖含量進行分析；采用LSD法對黃芪多糖的純化（過柱效果）進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 黃芪粗提樣品中多糖含量測定結果

分別以葡萄糖和葡聚糖為標準時，粗提樣品中黃芪多糖的含量為葡萄糖（52.7±2.4）%、葡聚糖（50.3±3.8）%。以葡萄糖為標準測得的含量高于以葡聚糖為標準的含量，但二者差異不顯著。

2.2 黃芪多糖純化結果

聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱對黃芪多糖的純化效果見表1和表2。由表1和表2可知，分別以葡萄糖和葡聚糖為標準時，利用聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱對黃芪多糖進行純化，均以去離子水、10%乙醇或30%乙醇洗脫效果為好，三者間差異不顯著。50%乙醇和70%乙醇的洗脫效果低于前三者，且差異顯著，尤以70%乙醇洗脫效果最差。

2.3 紅外光譜檢測

黃芪多糖粗提物、多糖純化、多糖硫酸酯樣品的紅外光譜如圖1所示。由圖1可知，在4 000～400 cm-1的波數范圍內，黃芪多糖的粗提物于3 301、2 893、1 605、1 362、1 024、843、676 cm-1處有明顯的吸收峰，為糖類化合物的一般吸收峰。過聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱的純化多糖吸收峰較為接近，除后者在709～688 cm-1附近有特征吸收峰外，其余各峰范圍基本一致（3 378～3 330 cm-1、1 635～1 621 cm-1、1 351～1 340 cm-1、1 023 cm-1）。黃芪多糖硫酸酯的紅外吸收光譜在4 000～1 641 cm-1及759～692 cm-1，與粗提物和純化樣品相似，但在1 249～1 150 cm-1和940 cm-1處出現了特有的吸收峰。

3 小結與討論

3.1 黃芪多糖含量測定

蒽酮比色法是目前常用的定糖方法。林炎坤[10]比較了蒽酮-稀硫酸外加熱法、蒽酮-濃硫酸外加熱法、蒽酮-硫酸水合熱法3種方法的定糖效果，指出稀硫酸法由于系統中硫酸比例較小，脫水反應困難，需煮沸10 min才能達到顯色高峰，且測得糖值低，為濃硫酸法的78%～82%；蒽酮-硫酸水合熱法雖不需外加熱，但反應系統中水和硫酸的比例很關鍵，且該法不適合對阿拉伯糖的測定，另外木糖、核糖等戊糖可能也不適于該方法；蒽酮-濃硫酸法反應體系中硫酸比例高，脫水作用強烈，加入蒽酮后沸水浴2～3 min可充分顯色，在沸水浴10～15 min效果均較好，顯色后30 min到3 h間吸光度值都很穩定。因此本研究中，參照楊莉等[6]的方法，加入蒽酮-濃硫酸后沸水浴2 min，然后混勻靜置60 min開始比色。

比色測定時選擇最大吸收所在波長為測定波長。楊莉等[6]測定黃芪多糖含量時，采用苯酚-濃硫酸法選擇490 nm波長，而采用蒽酮-濃硫酸法選擇625 nm波長；王淑萍等[2]用苯酚-濃硫酸法測定黃芪多糖含量，采用490 nm波長；王黎明等[11]用蒽酮-濃硫酸法選擇675 nm波長測定茶多糖含量；黃皓等[12]用蒽酮-硫酸法測定魔芋葡甘寡糖時最大吸收波長為620 nm。本試驗中，通過400～800 nm范圍內掃描，測得的最大吸收波長為625 nm。在蒽酮-濃硫酸作用下，葡聚糖與葡萄糖發生相同的顏色反應。因此，在測定多糖含量時以葡萄糖或葡聚糖為標準參照物有相同的效果。

3.2 黃芪多糖純化

劉星堦等[13]采用粗多糖乙醇沉淀，然后過Sephadex G-50柱，最后透析的方法得到純化多糖；吳麗等[14]將黃芪多糖脫蛋白沉淀物過DEAE-纖維素層析，然后透析，得到黃芪多糖；朱曉霞等[15]綜述了多糖純化的方法，這些研究從不同方面介紹了黃芪多糖純化的方法和優缺點，對后來研究提供了參考。

聚酰胺和AB-8大孔樹脂對黃芪多糖均有比較好的純化效果[2]。聚酰胺是化學吸附原理的氫鍵吸附，而大孔樹脂是物理吸附。對于樣品的細分或純化，較多采用聚酰胺柱，粗粉一般用大孔樹脂進行分段，二者的選擇要根據所純化的組分性質來定。本試驗中采取聚酰胺柱和AB-8大孔樹脂柱，同時以去離子水和乙醇進行洗脫，得到了黃芪多糖純化的較適宜條件，特別是以去離子水作為洗脫劑，多糖的純度可達90.8%。

吳麗等[14]的研究中，黃芪多糖先經脫除蛋白，然后再過柱純化。本試驗所用黃芪多糖是由生產廠家提供的粗提品，經測定粗蛋白含量較低，且多糖含量較高（CP<0.2%，APS>50%），因此沒有進行粗蛋白去除。

3.3 黃芪多糖硫酸化

多糖的化學修飾方法很多，如硫酸化、烷基化、乙酰化、硒化、羧甲基化、硬脂?；萚8]。利用糖殘基上的羧基、羥基、氨基等基團，運用化學方法進行修飾，可能會提高多糖的活性，現已成為糖藥物化學研究的一個重要分支。通過化學方法對多糖分子進行改性，使其具有更多的生物活性或者強化已有的生物活性，能夠更廣泛地應用于臨床。

多糖硫酸化常用的方法有：濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-吡啶法。氯磺酸-吡啶法因產物回收方便、收率較高，被較多采用[8]。多糖經硫酸酯化后，易與蛋白質特定的結構域結合，從而改變其構象，影響其生物活性和功能，使其具有明顯的抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病、增強免疫和抗凝血等活性[9]。本試驗通過氯磺酸-吡啶法獲得了黃芪多糖硫酸酯，為后續的研究提供了材料。

3.4 紅外光譜測定

特征吸收峰物質的紅外光譜是其分子結構的反映，光譜圖中的吸收峰與分子中各基團或鍵的振動形式相對應。通過比較大量已知化合物的紅外光譜，從中總結出各種基團或鍵的吸收規律。本試驗中4種樣品3 378～3 301 cm-1間為氫鍵的伸縮振動吸收；2 893 cm-1雖理論上為氫鍵振動吸收，但結合前人的研究分析[16]，應為次甲基的C-H伸縮振動，是糖類的特征吸收峰；1 641～1 340 cm-1間一般為C=O非對稱伸縮振動，其中對黃芪多糖來說，1 626 cm-1附近會有其多糖的水合振動吸收峰，這可作為黃芪多糖簡單的鑒別標準[17]；同時，與前人的研究[15]中黃芪多糖對照的紅外光譜（黃芪多糖的特征吸收峰為3 378、2 927、1 626、1 417、1 050 cm-1）比較分析，可知本試驗中的紅外光譜與對照基本一致。endprint

根據朱玉婷等[9]的研究表明，1 261 cm-1左右的吸收是S=O伸縮振動，808 cm-1左右的吸收是C-O-S的拉伸振動；馮秀梅等[7]研究表明，黃芪多糖硫酸酯在1 254.5 cm-1和818.0 cm-1處有硫酸酯鍵的特征吸收。本試驗的多糖硫酸酯化樣品的紅外光譜中可以看出，1 249 cm-1和940 cm-1處的吸收應該是黃芪多糖上的羥基被硫酸基取代形成的多糖硫酸酯鍵振動所產生。說明本試驗成功獲得了黃芪多糖硫酸酯。

除上述不同波數處的特征吸收外，紅外光譜也能為物質成分分析提供有用的信息。將本試驗的紅外光譜圖與系統自帶譜庫進行匹配，發現粗提物、純化及硫酸酯化樣品中均含有葡萄糖、羥丙基-β-環糊精、羥乙基-β-環糊精、異麥芽糖等糖類化合物，這為黃芪多糖的化學組成的分析提供了重要參考。

3.5 小結

本試驗中采用蒽酮-濃硫酸比色法測定黃芪粗提物中多糖含量時，以葡萄糖或葡聚糖為標準，結果二者沒有顯著差異；利用聚酰胺柱或AB-8大孔樹脂柱對黃芪多糖進行純化，用去離子水或30%以下的乙醇作為洗脫劑均可取得較好的效果，50%以上乙醇洗脫則效果較差；紅外光譜分析顯示，氯磺酸-吡啶法可以對黃芪多糖進行硫酸酯化，為深入研究黃芪中多糖的優化提純和硫酸化位點提供了依據。

致謝：本試驗得到長江大學動物科學學院肖立新老師和化學與環境工程學院鄒華老師的幫助，在此表示感謝。

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