豬細小病毒SYBR Green I熒光定量PCR診斷試劑盒的研制

余波+周思旋+譚詩文+徐景峨+史開志+楊莉

摘要：根據GenBank中豬細小病毒VP2基因序列設計特異性的引物，PCR擴增獲得豬細小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化，建立了豬細小病毒的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法，以此為基礎研制出試劑盒。試劑盒擴增產物的熔解曲線分析只出現1個單特異峰，無引物二聚體，對PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均無陽性信號擴增，可重復性好，測靈敏度可達1.0×101拷貝/μL。結果表明，研制的豬細小病毒SYBR Green I 實時熒光定量PCR試劑盒具有特異、靈敏、快速、重復性好等優點，適合于豬細小病毒臨床樣品的檢測。

關鍵詞：豬細小病毒；VP2基因；SYBR Green I熒光定量

中圖分類號：S852.65+9.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0126-04

豬細小病毒（Poreine parvovirus，PPV）是引起母豬繁殖障礙性疾病的主要病原體之一，可導致母豬流產、死胎，給養豬業造成了巨大的經濟損失[1-3]。目前，對該病的診斷方法包括傳統的病毒分離鑒定，以及血清學診斷方法，如ELISA、膠體金等。常規的PCR主要用于病死豬組織樣本的檢測，然而PPV常呈長期低劑量隱性感染，常規的PCR不僅無法對血清樣本中的病毒進行定量檢測，而且擴增反應后需要電泳檢測，操作繁瑣。熒光定量PCR是與常規PCR比較，具有重復性好、靈敏度高、能夠定量等優點，已經被廣泛應用于多種疾病病原的檢測[4，5]。本研究根據GenBank中豬細小病毒VP2基因序列設計特異性的引物，利用PCR技術擴增獲得豬細小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化，研制出豬細小病毒的SYBR Green I熒光定量PCR診斷試劑盒，為豬細小病毒臨床樣品的檢測提供科學的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：PPV強毒株7909、PRV閩-1株、PCV-2、CSFV、PRRSV、豬源大腸桿菌由貴州省畜禽疫病研究實驗室保存。

主要試劑及儀器：Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相應10×Taq Buffer、dNTP、DH5α，pMD-18T、SYBR Green I熒光定量PCR酶等購自寶生物（大連）工程有限公司；TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。熒光定量PCR儀為Eppendorf Mastercycler ep realplex 4 實時熒光定量PCR儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

根據GenBank中豬細小病毒VP2基因序列設計1對特異性引物，上游引物：5′-GGGAGGGCTTGG

TTAGAATC-3′，下游引物：5′-TTGTTTGCCATGAGTGAGTT-3′，引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取

1）組織樣品：取待檢樣品淋巴結組織樣品共約0.5 g，加入500 μL PBS緩沖液，待檢樣品研磨后 -70 ℃反復凍融3次，12 000 r/min離心取上清液用于核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取參照TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進行，將提取的DNA/RNA于-70 ℃保存。豬大腸桿菌參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行，將提取的DNA-20 ℃保存。

2）血清樣品：取50 μL血清加入等體積的血清裂解緩沖液[50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 μmol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1%Triton×100，5% SDS]，混勻后煮沸5 min，12 000 r/min離心取上清液2 μL用于熒光定量PCR和普通PCR。

1.2.3 pMD-18T-PPV-VP2陽性標準品的制備 用“1.2.1”中的引物，對PPV DNA進行PCR擴增，反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，退火溫度55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。將擴增的108 bp PCR產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA片段，與pMD-18T-克隆載體連接，轉化感受態細胞DH5α，重組體命名為pMD-18T-PPV-VP2，同時送寶生物工程（大連）有限公司測序。用紫外分光光度計測定測序正確的重組質粒pMD-18T-PPV-VP2在D260 nm/D280 nm處的吸光度，得到重組質粒的濃度和純度，進行10倍梯度倍比稀釋，作為陽性標準品。

1.2.4 熒光定量PCR反應條件的優化 熒光定量PCR反應在25 μL反應體系中進行，對熒光定量PCR反應條件，包括退火溫度（50、55、60 ℃），引物濃度（5、10、20 μmol/L），進行優化以確定最佳反應條件。上下游引物（5、10、20 μmol/L）各1 μL，Premix Ex-Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，模板1 μL，用超純水補足至25 μL，同時以超純水作為空白對照。反應條件為：94 ℃ 10 s；94 ℃ 5 s，退火溫度（50 ℃、55 ℃、60 ℃）10 s，72 ℃ 10 s，40個循環。

1.2.5 熒光定量PCR反應標準曲線的建立 用紫外分光光度計測定測序正確的重組質粒pMD-18T-PPV-VP2，計算出重組質粒的濃度和純度，計算DNA拷貝數，隨后將標準陽性樣本進行連續10倍系列稀釋，以“1.2.4”的條件進行擴增，每個稀釋倍數3個重復，以拷貝數為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立標準曲線。endprint

1.2.6 敏感性試驗 將重組質粒pMD-18T-PPV-VP2計算DNA拷貝數后，進行10倍比稀釋后分別進行熒光定量PCR反應，每個稀釋倍數3個重復，以確定建立的熒光定量PCR診斷的敏感性。

1.2.7 特異性試驗 以PPV、PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進行熒光定量PCR反應，每個樣品3個重復，以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性。

1.2.8 重復性試驗 應用建立的熒光定量PCR方法重復檢測PPV DNA樣品3次，以檢驗結果的可靠性。

1.2.9 試劑盒的組裝與保存期檢測 應用建立的熒光定量PCR組裝成試劑盒。試劑盒組成：①熒光定量PCR反應混合液；②ROX Reference Dye；③引物；④陰性對照；⑤陽性對照；⑥去離子水；⑦裂解液。將試劑盒各組份分別保存于室溫、4 ℃和-20 ℃，設置1周、6個月、1年3個時間梯度，對陽性菌株進行檢測。

1.2.10 熒光定量PCR試劑盒對臨床樣品的檢測 對2012～2013年貴州省貴陽市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區幾個生豬養殖場和養殖專業戶采集的69份疑似病料，181頭份發病豬場未發病豬血清，應用研制的試劑盒進行檢測，同時應用文獻[6]中的方法進行普通PCR。

2 結果與分析

2.1 pMD-18T-PPV-VP2陽性標準品的制備

用“1.2.1”中的引物，對PPV DNA進行PCR擴增，能有效擴增出了目的片段，片段大小為108 bp，無非特異性片段產生（圖1）。將寶生物（大連）工程有限公司測序結果與GenBank中的PPV-VP2基因序列比對，核苷酸相似度為98.9%～100%。

2.2 熒光定量PCR反應條件的優化

熒光定量PCR反應在25 μL反應體系中最佳反應條件為：退火溫度55 ℃，引物濃度10 μmol/L，能出現最高的熒光值、最小的Ct值，且在熔解曲線分析中不出現非特異性峰。

2.3 熒光定量PCR反應標準曲線的建立

將標準樣品10倍倍比稀釋，取1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷貝/μL 6種不同濃度重組質粒作為模板進行熒光定量PCR擴增反應，得到擴增反應的標準曲線（圖2），線性回歸方程為Ct=-3.141×lg拷貝數+26.7（R2=0.996）。

2.4 熔解曲線分析

在SYBR Green I熒光定量PCR結束后對擴增反應進行熔解曲線分析，結果見圖3。擴增產物的溶解溫度Tm為78.6～79.0 ℃，沒有引物二聚體和非特異性產物等其他峰值出現。

2.5 敏感性試驗

將標準樣品10倍倍比稀釋，取1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100 拷貝/μL 7種不同濃度重組質粒作為模板進行熒光定量PCR擴增。由圖4可知，結果顯示其靈敏度為1.0×101拷貝/μL。

2.6 特異性試驗

由圖5可知，以PPV、PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA進行熒光定量PCR反應，以確定建立的熒光定量PCR診斷方法的特異性，結果PPV為陽性，而PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA為陰性。

2.7 重復性試驗

應用建立的熒光定量PCR方法重復檢測PPV DNA樣品3次，以檢驗結果的可靠性，結果均一致。

2.8 試劑盒的組裝與保存期檢測

應用建立的熒光定量PCR組裝成試劑盒。試劑盒組成：①熒光定量PCR反應混合液（Premix Ex Taq）250 μL；② ROX Reference Dye 20 μL；③引物 40 μL；④陰性對照 20 μL；⑤陽性對照 20 μL，⑥去離子水500 μL；⑦裂解液 800 μL。將試劑盒保存在4 ℃、-20 ℃分別于1個月、3個月、6個月、1年對陽性樣品進行檢測，4 ℃保存1年陽性拷貝數降低99%，-20 ℃保存1個月、3個月、6個月、1年對陽性拷貝數無影響。

2.9 試劑盒對臨床樣品的檢測

對2012～2013年貴州省貴陽市、黔西南、遵義、黔南州、銅仁地區幾個生豬養殖場和養殖專業戶69份疑似病料（組織）的熒光定量PCR陽性率為36.2%（25/69），普通PCR陽性率為33.3%（23/69）。181頭份發病豬場未發病豬血清熒光定量PCR陽性率為10.0%（18/181），普通PCR陽性率為0%（0/181）。

3 小結與討論

豬細小病毒VP2基因是其主要免疫原性蛋白，在決定毒株的組織嗜性和致病性上起重要作用[7-9]。王金良等[10]應用豬細小病毒VP2全基因進行原核表達建立了間接ELISA檢測方法。趙俊龍等[11]根據豬細小病毒VP2基因，建立的豬細小病毒PCR方法能檢測出10-4×TCID50的病毒含量。但普通PCR檢測的靈敏度相對較低，主要用于組織病料的檢測，不能有效檢出豬群血清中PPV的隱形感染。李小康等[12]建立基于TaqMan探針的豬細小病毒熒光定量PCR檢測方法，該方法的敏感性為100拷貝/μL，可有效檢測出淋巴結、肺臟等組織中的PPV，但其未對感染豬場未發病豬血清進行檢測。

基于SYBR GreenⅠ的實時熒光定量PCR技術則無需探針，且價格較TaqMan探針低廉，但熒光染料能和任何雙鏈DNA結合。因此，它也能與非特異的雙鏈DNA（如引物二聚體）結合，容易產生假陽性信號，但可以通過融解曲線分析克服這一缺陷[13]。本研究根據豬細小病毒VP2基因序列設計特異性的引物，利用PCR技術擴增獲得豬細小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T載體上作為陽性標準品。通過對SYBR Green I熒光定量PCR反應條件的優化，建立了豬細小病毒的SYBR Green I熒光定量PCR診斷方法，靈敏度可達1.0×101拷貝/μL，擴增產物的溶解溫度Tm為78.6～79.0 ℃，沒有引物二聚體和非特異性產物等其他峰值出現，適合于臨床樣品的檢測。endprint

本研究中69份疑似病死豬病料（組織）中病毒含量量較高，因此熒光定量PCR和普通PCR符合率為92.0%，而發病豬場未發病豬血清PPV病毒含量較低，普通PCR未檢測到血清中的病毒，而研制的試劑盒能檢測到隱性感染的PPV。因此，本試劑盒可應用于PPV早期感染和隱性感染檢測，有利于豬場PPV的凈化。

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