竹柳細(xì)胞壁綜纖維素和木質(zhì)素單體及含量研究

李強(qiáng)　姜山

摘要：運(yùn)用超聲波輔助提取、DFRC（衍生化后的還原裂解）法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）細(xì)胞壁綜纖維素和木質(zhì)素單體進(jìn)行了測(cè)定；采用差重法和Kalson法結(jié)合紫外分光光度法測(cè)定了竹柳細(xì)胞壁綜纖維素和木質(zhì)素含量。結(jié)果表明，竹柳細(xì)胞壁綜纖維素單體包括D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質(zhì)素主要由愈創(chuàng)木基（G）和紫丁香基（S）組成。竹柳細(xì)胞壁綜纖維素含量為80.16%，木質(zhì)素含量為19.84%。

關(guān)鍵詞：竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）；綜纖維素；木質(zhì)素；衍生化后的還原裂解（DFRC）法

中圖分類號(hào)：S781.42 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）01-0097-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.025

植物細(xì)胞壁主要由綜纖維素、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)組成，作為植物光合作用產(chǎn)物的主要貯積方式，構(gòu)成了地球植物生物量的主要組成部分。纖維素是無(wú)水葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的長(zhǎng)鏈分子，半纖維素是戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖[1]，木質(zhì)素是由苯丙氨酸經(jīng)脫氨莖、羥基化、甲基化和氧化還原反應(yīng)，生成3種主要單體香豆醇、松柏醇和芥子醇，這些單體經(jīng)氧化偶聯(lián)聚合生成相應(yīng)的3種木質(zhì)素：對(duì)羥基苯基木質(zhì)素（H）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G）和紫丁香基木質(zhì)素（S）[2]。綜纖維素和木質(zhì)素是組成木材的主要成分，它們的組成及含量與木材的性質(zhì)以及木材的加工利用密切相關(guān)[3]。一般情況下，纖維素含量越高，則制漿率越高；而木質(zhì)素交聯(lián)在纖維素和半纖維之間形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是木材造紙的一大難題，木質(zhì)素含量越低，制漿漂白越容易，消耗的化學(xué)藥品越少[4，5]。通過(guò)基因工程方法調(diào)控木質(zhì)素含量和組成類型，優(yōu)化植物光合作用所生產(chǎn)的生物量在綜纖維素和木質(zhì)素之間的分配對(duì)木材的制漿性能有很大的潛在價(jià)值[6]。測(cè)定細(xì)胞壁中綜纖維素和木質(zhì)素單體成分及含量無(wú)疑為提升木材工業(yè)化應(yīng)用提供了重要參考依據(jù)。

竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）為楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）落葉喬木，是經(jīng)選優(yōu)選育出的一個(gè)柳樹品種，由于其同時(shí)具有染色體加倍實(shí)現(xiàn)的倍性優(yōu)勢(shì)和雜種優(yōu)勢(shì)，故不僅具備柳樹所有優(yōu)良特性，且具有生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、材質(zhì)好等特點(diǎn)，因此作為工業(yè)原料林具有一定優(yōu)勢(shì)[7]。以往對(duì)于竹柳的研究主要集中在纖維質(zhì)量及制漿性能方面，對(duì)于其細(xì)胞壁中綜纖維素和木質(zhì)素的單體成分及含量報(bào)道非常少。為此，采用超聲波輔助提取、衍生化后的還原裂解（DFRC）法結(jié)合GC-MS分析了竹柳細(xì)胞壁綜纖維素和木質(zhì)素單體成分，同時(shí)還采用差重法和Kalson法結(jié)合紫外分光光度法測(cè)定了綜纖維素和木質(zhì)素含量對(duì)DFRC法結(jié)果加以驗(yàn)證，以期為更好地開發(fā)利用竹柳奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為取自貴州省黔南地區(qū)的一年生竹柳。

儀器：QP2010c型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Shimadzu公司，數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST27、NIST147）；LX-02多功能粉碎機(jī)；101A-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱；HHS型電熱恒溫水浴鍋；分析天平（十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-1001型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）。

試劑：乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸、溴乙酰、二氧六環(huán)、鋅粉、膽固醇，均為市售分析純。

1.2 細(xì)胞壁樣品提取

樣品粉碎后，過(guò)60～80目篩，然后每克樣品加40 mL體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇超聲處理10 min，4 000 r/min離心5 min，去上清，重復(fù)4次，再依次用氯仿/甲醇（2∶1，V∶V）和丙酮抽提1次，空氣風(fēng)干[8]。

1.3 DFRC法分析細(xì)胞壁樣品

1.3.1 溴乙酰衍生和細(xì)胞壁溶解反應(yīng) 準(zhǔn)確稱量50 mg（W1）細(xì)胞壁樣品加到50 mL具塞三角瓶中，加入10 mL新鮮配制的溴乙酰溶液（溴乙酰∶乙醇=1∶4，V/V），蓋上玻璃塞于50 ℃輕輕攪拌3 h，然后在50 ℃以下負(fù)壓蒸干[9]。

1.3.2 還原斷裂反應(yīng) 向具塞三角瓶中加入10 mL二氧六環(huán)/乙酸/水（5∶4∶1，V/V/V），再加入200 mg（W2）鋅粉，常溫?cái)嚢?0 min，然后用砂芯漏斗過(guò)濾，濾渣于60 ℃烘至恒重（W3），濾液全部轉(zhuǎn)入預(yù)先備有15 mL二氯甲烷和15 mL飽和氯化銨的分液漏斗中，加入200 μL內(nèi)標(biāo)（80 mg膽固醇溶解于2 mL二氯甲烷），水相用3%的鹽酸調(diào)到pH 3以下，充分混勻，靜置分層并收集下部二氯甲烷相。另外用15 mL二氯甲烷萃取飽和氯化銨相，重復(fù)2次，合并二氯甲烷相，低壓旋轉(zhuǎn)蒸干，乙酰化后上GC-MS分析[10]。

1.3.3 計(jì)算反應(yīng)率 反應(yīng)率=■ （1）

1.4 竹柳細(xì)胞壁綜纖維素含量測(cè)定

稱取約1.5 g細(xì)胞壁樣品，于60 ℃烘至恒重W4，再轉(zhuǎn)入250 mL碘量瓶中，加入150 mL 2 mol/L的HCl，105 ℃保溫50 min，然后用去離子水沖洗過(guò)濾至濾液pH 6.5～7.0，接下來(lái)依次用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮各洗滌2次，殘?jiān)D(zhuǎn)入已恒重的坩堝（W5）中，于60 ℃干燥箱中烘至恒重（W6）。將殘?jiān)D(zhuǎn)入150 mL燒杯中，加入15 mL預(yù)冷過(guò)的72%的硫酸水解3 h，然后加去離子水135 mL，室溫過(guò)夜，殘?jiān)稳沼萌ルx子水沖洗過(guò)濾至濾液pH 6.5～7.0，濾渣轉(zhuǎn)入已恒重的坩堝（W7）中，于60 ℃干燥箱中烘至恒重（W8）。按公式（2）、（3）、（4）計(jì)算半纖維素、纖維素和綜纖維素含量，平行測(cè)定樣品6份，取平均值[11，12]。endprint

半纖維素含量=■×100% （2）

纖維素含量=■×100% （3）

綜纖維素含量=半纖維素含量+纖維素含量（4）

1.5 竹柳細(xì)胞壁木質(zhì)素含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱量1 g（W9）細(xì)胞壁樣品，加72%的硫酸15 mL，室溫?cái)嚢? h，轉(zhuǎn)入1 000 mL圓底燒瓶中，加560 mL去離子水稀釋硫酸濃度至3%，加熱回流2 h，再用砂芯漏斗過(guò)濾，收集濾液，殘?jiān)脽崴礈熘林行裕D(zhuǎn)入已恒重的坩堝（W10）于105 ℃烘干至恒重，稱量（W11）并按公式（5）計(jì)算酸不溶木質(zhì)素含量，平行測(cè)定樣品6份，取平均值[12，13]。

酸不溶木質(zhì)素含量=■×100% （5）

濾液在205 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，如果吸光度大于0.7，則用3%的硫酸溶液稀釋，當(dāng)吸光度為0.2～0.7，按公式（6）和公式（7）計(jì)算，平行測(cè)定樣品6份，取平均值。

B=■×D （6）

酸溶木質(zhì)素含量=■×100% （7）

式中，B為濾液中酸溶木質(zhì)素的含量（g/1 000 mL）；A為吸光度；D為樣品濾液的稀釋倍數(shù)；V為濾液總體積；110為吸光系數(shù)[L/（g·cm）]。

木質(zhì)素含量=酸不溶木質(zhì)素含量+酸溶木質(zhì)素含量 （8）

2 結(jié)果與分析

2.1 DFRC法分析細(xì)胞壁成分

衍生化后的還原裂解（DFRC）法包括兩個(gè)重要步驟：①細(xì)胞壁在溴乙酰和乙酸混合溶液中溶解，②鋅粉催化還原裂解，在溴乙酰中植物細(xì)胞壁被溶解，酸性環(huán)境下細(xì)胞壁多糖進(jìn)一步水解[14，15]，結(jié)合GC-MS通過(guò)查找數(shù)據(jù)庫(kù)可以確定樣品DFRC法獲得的化合物組成，進(jìn)一步解析樣品細(xì)胞壁成分。通過(guò)計(jì)算反應(yīng)率得出，大于95%的竹柳細(xì)胞壁參加了反應(yīng)，所以試驗(yàn)中DFRC法產(chǎn)物包含了竹柳細(xì)胞壁的主要物質(zhì)組成。

表1是竹柳細(xì)胞壁DFRC降解物氣相色譜檢測(cè)到的主要化合物保留時(shí)間、名稱以及含量，除9和10是內(nèi)標(biāo)膽固醇及其乙酰化產(chǎn)物外，1～8是竹柳細(xì)胞壁DFRC法檢測(cè)到的主要產(chǎn)物：D-木糖乙酸酯、L-阿拉伯糖乙酸酯、D-半乳糖乙酸酯、愈創(chuàng)木基乙酸酯、D-葡萄糖乙酸酯、紫丁香基乙酸酯、L-巖藻糖乙酸酯和D-纖維二糖乙酸酯。根據(jù)構(gòu)成綜纖維素和木質(zhì)素的單體類型可知，竹柳細(xì)胞壁綜纖維素單體主要是D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質(zhì)素的單體主要是G型和S型，沒(méi)有檢測(cè)到H型單體。不計(jì)算內(nèi)標(biāo)的情況下，綜纖維素和木質(zhì)素的含量分別為80.16%和19.84%。

2.2 竹柳細(xì)胞壁綜纖維素和木質(zhì)素含量分析

半纖維素是戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖，易水解，高溫下經(jīng)稀酸處理幾乎可以把半纖維素全部水解成可溶性糖；纖維素是β-1，4糖苷鍵組成的長(zhǎng)鏈分子，長(zhǎng)鏈分子進(jìn)一步形成一種具有高度結(jié)晶區(qū)的超分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以被濃酸溶解，在溶解過(guò)程中導(dǎo)致纖維素的均相水解[1]，因此依次用鹽酸、硫酸水解竹柳，準(zhǔn)確稱量水解前后的重量并計(jì)算差重可以得出半纖維素、纖維素以及綜纖維素含量。采用Klason法和紫外分光法分別測(cè)定酸不溶木質(zhì)素和酸溶木質(zhì)素含量，試驗(yàn)沒(méi)有檢測(cè)植物含有的少量礦質(zhì)元素，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知，綜纖維素含量為79.03%，木質(zhì)素含量為20.35%，對(duì)比DFRC法測(cè)定的糖類和木質(zhì)素類含量，可以得出兩種方法測(cè)得的結(jié)果基本一致，說(shuō)明DFRC法檢測(cè)出的竹柳細(xì)胞壁各成分含量可靠。

3 小結(jié)

竹柳細(xì)胞壁綜纖維素單體主要包括D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質(zhì)素單體主要為G型和S型。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，硬木H型木質(zhì)素單體含量一般很少甚至沒(méi)有，Lu等[9，14]在同是柳屬的柳樹中檢測(cè)到的H型木質(zhì)素單體含量相對(duì)于G型和S型也非常低（<1%），而試驗(yàn)在竹柳細(xì)胞壁中沒(méi)有檢測(cè)到明顯的H型木質(zhì)素單體，原因有可能是竹柳細(xì)胞壁中H型木質(zhì)素單體的含量過(guò)低，或是沒(méi)有H型木質(zhì)素單體的存在，這需要進(jìn)一步的試驗(yàn)論證。同時(shí)還測(cè)得綜纖維素含量為80.16%，木質(zhì)素含量為19.84%。試驗(yàn)中采用的DFRC法是美國(guó)威斯康星州牧草研究中心建立的用于解析細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的新方法，具有對(duì)試驗(yàn)條件要求不高、操作流程簡(jiǎn)潔和結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)鮮有將該方法運(yùn)用于硬木細(xì)胞壁的研究。利用該方法對(duì)竹柳細(xì)胞壁綜纖維素和木質(zhì)素單體及含量的研究，將為竹柳在工業(yè)木材應(yīng)用中的深入發(fā)展奠定一定的基礎(chǔ)，還可為其他工業(yè)木材的定性定量分析提供借鑒。

參考文獻(xiàn)：

[1] 何北海，林 鹿，孫潤(rùn)倉(cāng)，等.木質(zhì)纖維素化學(xué)水解產(chǎn)生可發(fā)酵糖研究[J].化學(xué)進(jìn)展，2007，19（7-8）：1141-1146.

[2] 蔣挺大.木質(zhì)素[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

[3] 黃安民，江澤慧，李改云.杉木綜纖維素和木質(zhì)素的近紅外光譜法測(cè)定[J].光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（7）：1328-1331.

[4] XU Z Y， ZHANG D D， HU J，et al.Comparative genome analysis of lignin biosynthesis gene families across the plant kingdom[J]. BMC Bioinformatics，2009，10（Suppl Ⅱ）：S3.

[5] 賈舉慶，胡尚連，孫 霞，等.四川2種叢生竹木質(zhì)素和纖維含量的研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（1）：197-200.

[6] GUO D J，CHEN F，INOUE K，et al.Down regulation of caffeic acid 3-O-Methyltransferase and Caffeoyl CoA 3-O-Methylatransferase in transgenic alfalfa：Impacts on lignin structure and implications for the biosynthesis of G and S lignin[J]. The Plant Cell，2001，13：73-88.endprint

[7] 李建國(guó)，張紅杰，雷 鳴.竹柳與兩種速生闊葉木的材性制漿性能比較[J].中華紙業(yè)，2012，33（18）：10-13.

[8] HATFIELD R D，GRABBER J，RALPH J，et al. Using the acetyl bromide assay to determine lignin concentrations in herbaceous plants： some cautionary notes[J]. J Agric Food Chem， 1999， 47（2）：628-632.

[9] LU F C，RALPH J.Derivatization followed by reductive cleavage （DFRC method），a aew method for lignin analysis： Protocol for analysis of DFRC monomers[J]. J Agric Food Chem，1997， 45（7）：2590-2592.

[10] MARTONE P T，ESTEVEZ J M，LU F C，et al.Discovery of lignin in seaweed reveals convergent evolution of cell-wall architecture[J]. Current Biology，2009，19（2）：169-175.

[11] 王玉萬(wàn)，徐文玉.木質(zhì)纖維素固體基質(zhì)發(fā)酵物中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的定量分析程序[J].微生物學(xué)通報(bào)，1987，14（2）：81-84.

[12] 杜甫佑，張曉昱，王宏勛.木質(zhì)纖維素的定量測(cè)定及降解規(guī)律的初步研究[J].生物技術(shù)，2004，14（5）：46-48.

[13] 段傳人，賈秋云.白腐菌混合菌降解木質(zhì)素最佳條件的優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009（12）：167-171.

[14] LU F C， RALPH J. The DFRC method for lignin analysis. 2. monoers from isolated lignins[J]. J Agric Food Chem，1998， 46（2）：547-552.

[15] 王少光，武書彬，朱小林.DFRC法在木素結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)造紙學(xué)報(bào)，2005，20（2）：178-183.endprint