殼聚糖和魚精蛋白對淡水污損黏附菌的抑制作用

劉念+熊燕飛+彭俊講+許瀚之+廖立菁+蔡小雨+許云

摘要：水下固形物表面微生物的黏附生長是生物污損層形成和生物腐蝕的初級階段。從長江水體分離得到三株淡水黏附菌，在前期對其形態特征進行研究的基礎上，對其黏附生長進行了初步研究，探討了殼聚糖和魚精蛋白兩種物質對它們生長、黏附的抑制作用。結果顯示，3種菌株在玻璃片上能迅速黏附，殼聚糖與魚精蛋白處理菌體后能明顯改變菌株生長或黏附情況；處理材料表面后能顯著改變材料表面能，引起不同的微生物黏附現象。

關鍵詞：淡水黏附菌；殼聚糖；魚精蛋白；細菌生長；黏附

中圖分類號：O636.1；Q939.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0027-04

水下設施及船體表面形成的生物污損層[1]是由多種生物及其附屬物構成的開放生態系統。研究表明，放在海水中的任何物體表面很快就被單層的有機質所覆蓋，稱為調節膜[2]，其后，細菌和其他微小的浮游生物，如原生動物和各種微藻及其孢子等開始黏附，這些微生物在調節膜的滋養下形成生物膜[3，4]，最先附著的微生物的生長會增加表面的粗糙度和疏水性[5]，防垢層表面的有機物又能作為微生物再生長的碳源[6]，進一步引導海綿、水螅、海藻、石灰蟲以及藤壺、貝類等次級附生物附著。生物污損是不可逆的，會導致膜的損壞從而增加操作成本[7]，給航運、海防及水產養殖等行業帶來巨大的經濟損失和安全隱患。

殼聚糖薄膜的潤濕性與膜表面的粗糙度有關，自然干燥的膜具有較大的粗糙度，穩定的具有微納米結構的殼聚糖膜有望成為防污、防水、防霧、自清潔、無損運輸等良好的膜材料[8，9]。

本試驗重點研究了殼聚糖、魚精蛋白及利用它們改性之后的材料對分離得到的三種淡水黏附菌的生長、黏附帶來的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：長江武漢市段黃鶴樓輪渡引橋水線下約20 cm處懸片取樣分離的菌株，分別記為AB-w，AB-y，AB-ly，作為試驗菌株。

培養基：牛肉膏蛋白胨固體培養基，牛肉膏蛋白胨液體培養基。

主要試劑：殼聚糖，平均相對分子質量300.00，脫乙酰度85%（青島海洋研究所）；硫酸魚精蛋白，生化試劑（BR，國藥集團化學試劑有限公司）；戊二醛，分析純（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；其他常用試劑均為分析純（AR）。

1.2 方法

1.2.1 試驗菌株的分離培養與純化 長江武漢市段黃鶴樓輪渡引橋水線下約20 cm處，懸掛滅菌載玻片，分別于0.5、1 、2 、6、24 h取出，采用影印法，將載玻片上菌體印跡至牛肉膏蛋白胨固體平板上，37 ℃恒溫培養24 h，觀察比較掛片不同時長后玻片黏附菌的數量及種類。選取優先黏附、數量較多的菌落，用平板劃線法進行二次分離純化，革蘭氏染色觀察。

1.2.2 試驗菌株的生長、黏附觀察 將試驗菌株從37 ℃過夜活化牛肉膏蛋白胨固體斜面保種管中取兩環，接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，37 ℃，100 r/min空氣搖床培養3 h后作為菌液。

取菌液700 μL加入50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，分別添加700 μL無菌去離子水、20 mg/mL殼聚糖溶液、10 mg/mL魚精蛋白溶液，每瓶培養基中以銅絲籠置入兩片蓋玻片，37 ℃，100 r/min空氣搖床培養。到預定時間后觀察培養基情況后將蓋玻片取出，以4 mL無菌去離子水輕輕沖洗兩面后，在無菌濾紙上晾干，取未接觸濾紙一面連續兩次印跡于牛肉膏蛋白胨固體平板上，37 ℃培養24 h。

1.2.3 殼聚糖和魚精蛋白對試驗菌株的抑制生長觀察 取200 μL菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養基表面，略微靜置，分別滴加50 μL 100.0、33.3、20.0 mg/mL殼聚糖溶液與10.0 mg/mL魚精蛋白溶液，37 ℃培養24 h。

1.2.4 殼聚糖溶液對菌株生長的影響 利用96孔細胞培養板探究不同濃度殼聚糖溶液對菌株生長的影響。設置空白培養液組及試驗菌株培養組，調節殼聚糖終濃度分別為0.000 0、0.037 5、0.075 0、0.150 0、0.300 0、0.600 0 mg/mL，每個濃度4次重復，每孔溶液總量100 μL。酶標儀中等強度振蕩10 s后630 nm處測量每孔的吸光度，37 ℃靜置培養20 h后重復測量。

1.2.5 改性材料檢測及微生物黏附情況觀察 蓋玻片經高溫蒸氣滅菌，浸入1%戊二醛溶液中，60 ℃恒溫水浴1 h。取出后放入15 mL無菌去離子水中浸洗3次，無菌濾紙上晾干。分別置入現制的6 mg/mL殼聚糖溶液、20 mg/mL魚精蛋白溶液、無菌去離子水中，4 ℃靜置8 h，取出晾干，置于無菌培養皿中暫存。

將處理后的材料分為4組，一組以水在空氣中測量接觸角，重復測量5次，運用MATLAB R2012a，根據改進的Berthelot規則[10]，計算材料表面能。

取兩組以銅絲籠固定，于武漢市黃鶴樓輪渡引橋處水線下分別懸吊15、30 min取出，以少量無菌去離子水沖洗表面雜質后自然干燥，其中30 min組經結晶紫簡單染色后使用奧林巴斯倒置熒光顯微鏡觀察，15 min組與剩下一組材料使用Hitachi S-4800場發射掃描電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 試驗菌株分離結果

獲得3種主要菌株，根據菌落顏色分別命名為AB-w（Adhesion bacteria-white），AB-ly（Adhesion bacteria-light yellow），革蘭氏染色陰性；AB-y（Adhesion bacteria-yellow），革蘭氏染色陽性。

2.2 試驗菌株生長、黏附情況

3種試驗菌株在添加有殼聚糖溶液（終濃度0.30 mg/mL）的培養瓶中培養，開始時無明顯異常，37 ℃搖床培養1 h后皆出現絮狀沉淀，培養基明顯較空白對照組清澈。而添加有魚精蛋白溶液（終濃度0.14 mg/mL）的培養瓶明顯較空白對照組渾濁。如圖1所示，AB-y、AB-w菌株與AB-ly菌株情況類似。前期試驗結果顯示3組培養瓶在添加相應溶液之前菌體數量無數量級差異，推知此現象為添加相應溶液所引起，若降低殼聚糖終濃度至0.20 mg/mL則無明顯絮狀沉淀出現。endprint

通過與對照組對比可知，在培養時間為1 h時，添加殼聚糖可以部分減少AB-ly、顯著抑制AB-y在蓋玻片上的黏附；添加魚精蛋白可以有效減少AB-ly、明顯抑制AB-y在蓋玻片上的黏附；而兩種物質對AB-w均無明顯的抑制黏附作用。若縮短培養時間為15 min，兩種物質對AB-y的抑制黏附作用明顯減弱，如圖2所示。推知0.14 mg/mL的魚精蛋白溶液對于AB-ly、AB-y的抑制黏附效果優于0.30 mg/mL殼聚糖的效果。實驗室條件下培養時間適當延長可以增強兩種物質抑制AB-y黏附的效果。

2.3 抑菌圈大小

3種菌株對于兩種物質的敏感性不一。其中AB-y、AB-ly對于兩種物質的敏感性類似，隨著殼聚糖溶液濃度的降低，溶液黏度明顯降低，抑菌圈增大較明顯；10.0 mg/mL的魚精蛋白溶液可以顯著抑制兩種菌的生長。對于AB-w，3種濃度下殼聚糖抑制效果不明顯，魚精蛋白抑制效果一般（圖3）。

2.4 低濃度殼聚糖溶液對菌株生長的影響

大幅度降低殼聚糖濃度后，3種菌株的反應不同。AB-y生長未受明顯影響；AB-ly在濃度為0.300 0 mg/mL前生長有小幅增強，0.300 0 mg/mL后生長受到抑制；AB-w在試驗濃度下都出現受抑制現象，隨著濃度的升高抑制效果增強，在0.150 0 mg/mL到0.300 0 mg/mL區間內變化顯著，隨后變化幅度的降低。結合抑菌圈試驗推知為得到良好的抑制生長效果，AB-y需要較高的殼聚糖溶液濃度，AB-ly相對較低，AB-w最低。過高的殼聚糖溶液濃度因為其黏度的顯著增加會明顯降低抑制生長效果（圖4）。

2.5 改性材料性質及微生物黏附情況對比

蓋玻片經過改性后，材料表面能發生明顯變化，如表1和圖5所示。從表1和圖5可以看出，戊二醛處理后，材料接觸角稍微變大，表面能略有降低，疏水性小幅增加；戊二醛與殼聚糖共同處理后，材料接觸角明顯變大，表面能顯著降低，表現為疏水性；戊二醛與魚精蛋白共同處理后，魚精蛋白的加入使得材料接觸角、表面能、疏水性都與未經處理的蓋玻片類似。

如圖6所示，從材料在江水中懸吊前后的掃描電鏡結果可以看出，浸泡之前，在放大20 000倍下空白對照可以看到明顯的劃痕；戊二醛處理后材料表面存在部分塊狀物；殼聚糖溶液處理后材料表面存在明顯的膜狀物，可解釋為殼聚糖膜干燥過程中，隨著溶劑及水分的蒸發，殼聚糖在溶液狀態下較為伸展的分子鏈由于脫溶劑化而不斷卷曲，分子鏈間的纏繞或結合趨于緊密。自然干燥條件下殼聚糖溶液蒸發速率較低，干燥時間長，分子鏈得到了充分卷曲和纏繞，因此形成膜的晶粒較粗大，使得薄膜結構粗糙[9]；魚精蛋白溶液處理后可看到部分不規則顆粒。在江水中懸吊浸泡15 min之后，材料表面都發生了較大變化。其中以空白對照最為明顯。

比較之后可以發現經過殼聚糖與魚精蛋白處理過后的材料表面雖然有層狀堆積，但層狀堆積大小不一，堆積無明顯規律，堆積較松散，懸吊前原有結構被層狀堆積覆蓋依稀可見；空白對照層狀堆積明顯，有一定的規律性，原有結構無法分辨；戊二醛處理組原本塊狀物消失，出現成片的堆積物。

從倒置熒光顯微鏡下觀察懸吊材料可知，不同處理后微生物的黏附情況有很大不同。其中空白對照吸附有大量的細菌，細菌間無明顯聚集成團現象，細菌排列有一定的規律，無其他微生物的黏附；戊二醛處理材料表面細菌數量較少，分布較散，無明顯規律性，無其他微生物黏附；殼聚糖處理材料表面有多種微生物黏附，存在明顯的聚集成團現象，細菌黏附相對較少；魚精蛋白處理材料無多種微生物黏附現象，細菌黏附相對較少，部分分散，部分存在多個細菌有序排列成三叉狀（圖7）。推測上述現象是由于戊二醛處理后一定程度上降低了細菌對材料的黏附，有機物殼聚糖由于良好的成膜性，在材料表面形成了一層有機膜，一定程度上吸引了比細菌高等級的微生物的黏附；魚精蛋白在材料表面分散分布，不會形成明顯的有機膜，所以不像殼聚糖處理材料那樣會黏附其他種類的微生物，而且由于魚精蛋白的存在，導致部分細菌發生比較規律的聚集。猜想殼聚糖與魚精蛋白處理后隨著時間的延長，這些聚集的細菌會被剝落，從而達到抑制細菌黏附的作用。

3 小結與討論

1）殼聚糖與魚精蛋白對分離得到的3種黏附菌確實有一定的抑制生長或黏附的作用，但是分離得到的3種黏附菌間對于殼聚糖及魚精蛋白處理后的響應具有一定的區別。0.14 mg/mL魚精蛋白對抑制AB-y與AB-ly的黏附效果較好，對AB-w沒有明顯的抑制效果。10.0 mg/mL魚精蛋白對AB-y與AB-ly有著相似的抑制生長作用，但是對AB-w作用一般。為得到良好的抑制生長效果，AB-y需要較高的殼聚糖濃度，AB-ly相對較低，AB-w最低。

2）針對AB-y菌株，相同濃度的殼聚糖與魚精蛋白溶液處理下，適當延長培養時間更有利于抑制AB-y在材料表面的黏附。

3）材料經過處理后有了明顯的改變，殼聚糖處理的材料表現出較強的疏水性，魚精蛋白處理的材料表現出較強的親水性，二者都能顯著改變微生物在其表面的黏附狀態。

4）殼聚糖與魚精蛋白抑制分離得到的3種黏附菌生長或黏附的最佳濃度還有待進一步確認，魚精蛋白抑制黏附的濃度不同可能對促進細菌生長的效果不同。

5）殼聚糖與魚精蛋白處理材料的方法、材料的耐久性以及抑制黏附的機理還需要進一步探究。這二者的共同點是帶有大量的正電荷，這一點可能是抑制細菌黏附，避免生物污損的一個方法。

參考文獻

[1] 嚴 濤，嚴文俠，董 鈺，等.海南島東部海域生物污損研究[J].海洋與湖沼，1998，29（4）：374-380.

[2] 宋永香，王志政.海洋生物及其粘附機理——微生物、小型海藻、巨型海藻、貽貝[J].中國膠粘劑，2002，11（4）：48-52.

[3] 李 燕，高亞輝，李雪松，等.海洋硅藻附著研究進展[J].生命科學，2008，20（5）：768-772.

[4] 黃智慧，馬愛軍，汪 岷.魚類體表黏液分泌功能與作用研究進展[J].海洋科學，2009，33（1）：90-94.

[5] PASMORE M，TODD P，SMITH S，et al.Effects of ultrafiltration membrane surface properties on Pseudomonas aeruginosa biofilm initiation for the purpose of reducing biofouling[J]. J Membrance Sci，2001，194（1）：15-32.

[6] VAN DER HOEK J P， HOFMAN J A M H， BONN P A C， et al. RO treatment： Selection of a pretreatment scheme based on fouling characteristics and operating conditions based on environmental impact[J]. Desalination，2000，127：89-101.

[7] SAAD M A. Biofouling prevention in RO polymeric membrane systems[J]. Desalination， 1992，88（1-3）：85-105.

[8] 周娓娓，于春玲，金美花，等.殼聚糖膜的制備及其表面浸潤性[J].大連工業大學學報，2012（4）：262-264.

[9] 趙宏霞，金 花，蔡繼業.不同干燥條件下殼聚糖膜表面的微觀結構及微觀力學性能[J].物理化學學報，2010，26（3）：649-653.

[10] 劉永明，施建宇，鹿芹芹，等.基于楊氏方程的固體表面能計算研究進展[J].材料導報，2013（11）：123-129.endprint