單管多重檢測急性早幼粒細胞白血病PML-RARa融合基因3種剪切體RT-qPCR方法的建立及臨床應用

單管多重檢測急性早幼粒細胞白血病PML-RARa融合基因3種剪切體RT-qPCR方法的建立及臨床應用

本刊主編，武漢大學人民醫院李艷教授(通訊作者)指導博士研究生陳占國(第一作者)等在《PLOS ONE》(2015，10(3)e0122530，IF：3.534)發表了題為“Development and validation of a 3-plex RT-qPCR assay for the simultaneous detection and quantitation of the three PML-RARa fusion transcripts in acute promyelocytic leukemia”的研究論文，主要內容如下：

1研究背景和目的：融合基因PML-RARa陽性急性早幼粒細胞白血病(APL)患者的早期、快速診斷，將有助于APL患者早期應用反式維甲酸(ATRA)進行有效“靶向”治療，以減少APL患者致死性出血及其并發癥。然而，目前的PML-RARa的RT-qPCR檢測方法存在相對費時、費力、試劑成本高等不足。現有方法的檢測過程需要3個PCR反應體系同時檢測PML-RARa融合基因可能存在的3種剪切體，雖每例患者只攜帶一種剪切體的PML-RARa融合基因。本課題組設計了一套特殊的“PML-RARa引物和探針”，用最少的引物和探針單管多重檢測APL患者PML-RARa融合基因可能存在的3種剪切體，即PML-RARa bcr1、PML-RARa bcr2和PML-RARa bcr3，以便于臨床對APL的分子診斷。

2主要方法：根據探針和引物的設計原則，利用PML-RARa通用引物對PML-RARa陽性標本進行篩選，采用“PCR產物膠回收+PCR產物測序”等方法加以驗證，課題組發現了PML-RARa較少見的PML-RARa融合基因bcr2剪切體的拼接位點(與文獻報道進行了比對)，成功設計出一套特殊的RT-qPCR引物和探針，即2條正向引物、1條反向引物和1條TaqMan MGB探針。通過ABI熒光定量PCR儀進行RT-qPCR的條件優化，課題組成員確定了PML-RARa三重RT-qPCR檢測體系；最后對該體系進行性能評價。

3結果：根據所篩選的PML-RARa標本，課題組對PML-RARa的3種剪切體進行克隆，得到陽性克隆質粒，作為RT-qPCR的質粒標準品。PML-RARa檢測體系的性能評價結果如下：(1)針對課題組所研發的質粒標準品，檢測體系的最低靈敏度為10拷貝/每反應；(2)針對PML-RARa陽性的APL細胞株NB4，檢測靈敏度為10-4，即104背景細胞中檢測到一個APL腫瘤細胞；(3)批內和批間的重復性試驗證實，該體系的變異系數(CV)均小于3%；(4)對319例確認為白血病(含61例APL)的初發患者骨髓樣本的檢測結果與用于PML-RARa檢測的傳統方法比較，其定性結果完全吻合；(5)本方法同時與歐洲抗癌計劃協作組(EAC)推薦的單重RT-qPCR定量方法的比較結果為，對60例APL初診骨髓標本和199例來源于57例APL患者治療監測的隨訪骨髓標本采用兩種方法所得PML-RARa定量結果以及靈敏度均具有高度一致性。用本課題組研發的檢測體系，檢測到1例APL患者存在PML-RARa融合基因 bcr2剪切體，但用EAC推薦的單重RT-qPCR方法，其結果為陰性。經測序驗證，該例標本融合基因的斷裂點為PML外顯子6的nt1579位置。

4結論：本課題所研發的PML-RARa多重RT-qPCR方法特異、敏感、穩定、高效，可提高PML-RARa融合基因的檢測效率，并簡化了檢測流程，大大降低了現有RT-qPCR試劑可能存在的漏檢情況，可用于PML-RARa陽性APL患者的診斷和治療監測。

注：該研究為國家自然科學基金資助項目(81000771)