C-反應蛋白上轉發光免疫層析試紙條的研制

周明澤

(北京熱景生物技術有限公司，北京100076)

上轉磷光技術(UPT)是近年來發展起來的一種具有高靈敏度，基于上轉磷光體UCP的新型生物檢測技術［1］。其中，上轉磷光顆粒是納米級的晶體顆粒，它由包埋于氧化硫等惰性材料中的稀土鑭系元素組成。其特性可由紅外線激發，而發射紅、藍、綠等不同波長的可見光［2］。磷光信號可由改進的落射顯微鏡進行觀察，并可用計算機系統進行檢測和分析，達到定性、定量檢測生物活性分子的目的［3］。

UCP具有高度的靈敏性、穩定性、簡易性、靈活性、安全性等獨特光學特性，使其作為新型標記物在生物檢測領域將發揮巨大的潛能。迄今為止，上轉磷光技術已被應用于免疫標記分析、免疫層析分析等多種標記檢測技術中。近年來發現C-反應蛋白濃度甚至在正常范圍內的輕度升高都與心血管疾病發生的危險性增加有關，可以推測心肌梗死事件發生的可能性。超敏C-反應蛋白是心腦血管疾病中的一項獨立風險預測指標，可以敏感地預測糖尿病合并心腦血管事件的危險發生率［4］。所以CRP的定量測定至關重要。

CRP是一種能與肺炎鏈球菌C多糖體反應的急性時相蛋白，在組織損傷、感染等刺激下，被激活的單核細胞釋放白細胞介素1(IL．1)，刺激肝細胞加速合成CRP，對炎癥感染的發生發展存在很大的相關［5－6］。筆者是在雙抗體夾心免疫分析的基礎上建立起來的檢測方法，具有反應時間短，靈敏度高，特異性、準確性、穩定性好，無環境污染和放射危害的特點［7］。

1 材料與方法

1．1 抗體配對篩選 抗體配對篩選采用的是同時對幾組抗體標記及包被，最后相互配對來測定CRP校準品，根據試驗結果來選擇標記及包被抗體。主要利用克隆號為3B11、3C8等抗體來標記及包被，包被量按2．0 mg/ml，標記比例按mucp∶m抗體=20∶1來測定CRP校準品，最終根據測定的靈敏度、測定結果梯度及反應強度等來選擇抗體配對。

表1 抗體配對組合

1．2 反應條件的選擇 由于CRP測定過程中反應時間對測定結果有影響，為了滿足臨床快速診斷的要求，同時也要保證試劑測定的準確性及符合率，故在相同的試紙條測定相同樣本在不同時間的變化，該試驗主要是加樣孔中分別加入稀釋后的樣本100μl，室溫反應不同時間后，測量各試紙條的T/C值來平行對比。

2 結果與分析

2．1 抗體配對篩選 由圖1可知，經過2株抗體3B11及3C8的相互配對，結果表明:①3C8標記和3B11包被測定結果靈敏度好，線性相關也很好，在抗體配對中，該標記、包被的配對情況均符合要求;②3B11標記和3C8包被測定結果靈敏度不是特別好，線性相關也不是特別好，但抗體配對仍有反應，若3C8標記與3B11配對仍無法調節到最優，可以考慮使用此配對方案來調整;③3C8標記及3C8包被配對不成功，反應均沒有一定的梯度，高濃度仍與陰性相同;④3B11標記及3B11包被配對并不是最好，線性相關并不好，目前暫且不使用此配對。綜上分析，目前CRP測定使用3C8標記和3B11包被，可以實現一個較優組合。

2．2 反應條件的選擇 由圖2可知，反應5 min時T/C值較低，線性也不夠理想，反應10～20 min時T/C值基本穩定，線性、靈敏度也較滿意。考慮到免疫層析反應的特點，一般15 min才能完成層析過程，所以選擇15 min作為反應時間。

3 討論

上轉換發光材料的出現為免疫層析技術的發展提供了新的空間。自然界中所有物質的發光過程均需遵循Stokes規則，即發射光的波長長于激發光的波長［8］。

上述特點使得UCP作為生物標記物有著極為廣泛的應用前景。因而在以抗原抗體為代表(還可包括核苷酸等)的UCP標記技術平臺的基礎上，使其與免疫層析技術相結合，再利用微型化的光電子材料可以開發出一種靈敏、快速、操控簡易的免疫診斷分析儀［9］。

目前美國國防部研制的UPT儀器用于生物防恐檢測鼠疫、定量檢測炭疽芽孢，美國Orasure公司研制的UPT儀器用于檢測艾滋病病毒抗體、毒品含量定量檢測等，我國國內科研單位如軍事醫學科學院流行病研究所楊瑞馥課題組研究該領域已經將近10年，已經研制成功鼠疫、O157細菌、炭疽芽孢、表面抗體定量檢測等免疫層析檢測試劑，相關文獻發表20余篇，SCI文獻發表10 余篇［10］。

4 結論

該研究主要在上轉發光技術平臺上，通過抗體篩選、反應條件的選擇來確立C-反應蛋白測定條件，建立起包被濃度2 mg/ml和反應時間15 min時，與人血清白蛋白、膽紅素等結構類似物無交叉反應，且具有反應時間短，靈敏度高，特異性、準確性、穩定性好，無環境污染和放射危害的試劑。同時通過抗體配對篩選，3C8標記和3B11包被可以實現一個較優組合，2 mg/ml的包被濃度及反應時間在15 min時，能保證T/C值，線性和靈敏度較好。

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