細胞分裂相關基因Spc25的分子進化研究

邢雪琨

(新鄉醫學院生命科學技術學院，河南新鄉453003)

染色體不穩定性與腫瘤形成有密切的關系［1－2］。多種因素能導致染色體的不穩定，如染色體分離、細胞周期檢驗點、DNA損傷等。在有絲分裂的染色體分離過程中，動粒與微管的結合起著重要的調節作用。眾多蛋白參與該活動，Ndc80復合體就是其中關鍵的一員。Ndc80復合體由Hec1、Nuf2、Spc24 和 Spc25 4 種蛋白組成［3－5］。Spc25 作為 Ndc80復合體的組成部分，可能是動粒－微管形成機制的一部分，涉及有絲分裂和腫瘤發生的重要環節。雖然學者們針對Ndc80開展了大量研究，然而對于Ndc80的作用機制仍不清楚，對Spc25更是知之甚少。

筆者采用生物信息學手段分析在不同生物中Spc25基因的長度多態性、終止密碼子多態性、外顯子個數變化、氨基酸序列多樣性和該基因編碼的保守區，并在此基礎上建立不同生物Spc25基因上的進化圖譜，初步了解不同生物Spc25基因的演化關系，為研究該基因參與染色體分離和腫瘤發生的作用機理提供資料。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 在NCBI中輸入“Spc25”搜索得到多種生物的基因序列，挑選分別代表真菌、無脊椎動物昆蟲、脊椎動物魚、兩棲、爬行、鳥和哺乳動物7類生物的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、果蠅(Drosophila melanogaster)、斑馬魚(Danio rerio)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、海龜(Chelonia mydas)、緬甸蟒蛇(Python bivittatus)、原鴿(Columba livia)、原雞(Gallus gallus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus museulus)、大鼠(Rattus norvegieus)、牛(Bos taurus)、恒河猴(Macaca mulatta)、馬(Equus caballus)16種不同生物進行Spc25基因分析。

1．2 試驗方法

1．2．1 序列長度多態性分析。分析Spc25基因及其ORF序列，以得到不同生物Spc25基因長度的變異及序列特征。

1．2．2 終止密碼子變異分析。統計Spc25基因的終止密碼子變異情況，為研究Spc25基因轉錄調控機制提供資料。

1．2．3 外顯子個數分析。統計Spc25基因的外顯子個數，分析該基因轉錄的調控情況。

1．2．4 氨基酸序列的同源性比對。用DNAMAN軟件中的Alignment程序對Spc25基因編碼的氨基酸序列進行同源性比對，并分析其保守區域，構建系統進化樹。

2 結果與分析

2．1 序列長度多態性 核酸序列分析表明，Spc25基因序列變化較大，從釀酒酵母的666 bp到粟酒裂殖酵母的4 156 bp，相差3 490 bp。但開放閱讀框(open reading frame，ORF)長度都在666～717 bp，其中釀酒酵母666 bp較短，粟酒裂殖酵母717 bp較長(表1)。說明在進化過程中，盡管不同生物所處環境不同，基因調控有較大差異，但編碼序列比較保守，從真菌到脊椎動物變化都較小。

2．2 終止密碼子變異分析 在所研究的l6種生物中，有13種Spc25基因都是以TAA作為終止密碼子，有3種(果蠅、小鼠和大鼠)以TGA作為終止密碼子，沒有以TAG作為終止密碼子(表1)。說明生物有以TAA作為終止密碼子的傾向。

2．3 外顯子個數分析 真菌和無脊椎動物Spc25基因有1～3個外顯子，脊椎動物中魚、兩棲、爬行和鳥類的外顯子個數在6～8個，哺乳動物除恒河猴9個外顯子外，都有8個外顯子(表1)，說明在進化過程中，Spc25基因外顯子有從少到多的過程，最后趨于有8個外顯子。

2．4 氨基酸序列的同源性比較 用DNAMAN中的Alignment程序對16種生物Spc25基因編碼的氨基酸序列進行比較，發現脊椎動物間Spc25同源性在9．5% ～100．0%，特別是哺乳動物間同源性較高，人和恒河猴的同源性達100%。但真菌、無脊椎動物與脊椎動物差別較大，它們的相似性僅在6．8%～20．5%(表2)。所有生物最后的130個氨基酸是Spc25最為 保守的區域(圖1)，可能與其功能有重要關系。

表1 Spc25基因序列多態性

表2 Spc25氨基酸序列的同源性比較%

2．5 Spc25基因的分子進化樹 用DNAMAN中的Alignment程序繪制上述16種生物Spc25基因的分子進化樹(圖2)，除真菌中的釀酒酵母與無脊椎動物的果蠅聚在一起外，其他生物都是同一類的生物聚在一起，而且親緣關系與物種進化順序一致。

3 討論

Spc25是參與動粒-微管相互作用的Ndc80復合體的成分之一。生物信息學分析表明，Spc25基因的開放閱讀框從真菌到脊椎動物變化都較小，幾乎都在666～717，編碼序列比較保守。大部分生物有以TAA作為終止密碼子的傾向，沒有以TAG作為終止密碼子的。Spc25基因外顯子有從少到多的過程，最后趨于有8個外顯子。哺乳動物間氨基酸序列高度同源，最后的130個氨基酸是Spc25最為保守的區域。以上研究結果提示Spc25是一個較為保守的基因，在動粒－微管的連接中發揮了重要作用，它的穩定表達對染色體的穩定性和抑制腫瘤發生起著關鍵作用。

［1］VENKITARAMANA R．Chromosome stability，DNA recombination and the BRCA2 tumour suppressor［J］．Curr Opin Cell Biol，2001，13(3):338 －343．

［2］VENKITARAMAN A R．Tumour suppressor mechanisms in the control of chromosome stability:Insights from BRCA2［J］．Mol Cells，2014，37(2):95－99．

［3］UMBREIT N T，GESTAUT D R，TIEN J F，et al．The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(40):16113 －16118．

［4］CIFERRI C，PASQUALATOS，SCREPANTIE，et al．Implications for kinetochore-microtubule attachment from the structure of an engineered Ndc80 complex［J］．Cell，2008，133(3):427 －439．

［5］ALUSHINGM，MUSINIPALLY V，MATSON D，et al．Multimodal microtubule binding by the Ndc80 kinetochore complex［J］．Nat Struct Mol Biol，2012，19(11):1161 －1167．