一種DNA疫苗載體－磷酸鈣納米顆粒的基因轉染能力評價

馬淑燕，許利耕

(1．蘇州大學生物醫學研究院，江蘇蘇州215123;2．蘇州大學功能納米與軟物質研究院，江蘇蘇州215123)

目前臨床上疫苗多采用減毒或滅活的病毒/細菌作為載體，然而其潛在的安全性問題限制了其在臨床上的廣泛應用。近年來，DNA疫苗由于生產成本低、安全性好，可同時攜帶多種抗原且能同時刺激機體產生細胞免疫和體液免疫反應，逐漸成為疫苗研究領域的熱點［1］。然而，由于裸DNA很難進入機體且極易被核酸酶降解，從而嚴重影響了其免疫原性［2］。因此，研究開發出安全、有效的疫苗載體或佐劑成為目前亟待解決的問題。

相對于病毒載體，非病毒載體具有更好的安全性。近年來，由于納米技術的飛速發展，作為非病毒載體，納米材料由于其易于合成和加工修飾、可促進功能分子進入細胞等特點而越來越受到人們的關注。理想的疫苗佐劑應該具有增強抗原的免疫原性;可同時刺激機體產生細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫反應;生物可降解、經濟且易于制備等特點。鋁佐劑和MF59是目前公認的可用于人體的2種疫苗佐劑，然而這2種佐劑均難以有效刺激機體產生細胞免疫反應［3］。同時，鋁佐劑可導致注射部位炎癥反應的發生且持續時間較長［4］。相對于鋁佐劑，磷酸鈣具有更多優勢，如生物可降解、對注射部位無刺激等。歐洲一些國家已批準磷酸鈣作為佐劑應用于人體［5］。磷酸鈣顆粒的合成方法主要包括共沉淀法［6］和反向微乳液法［7－10］等。然而，共沉淀法制備的磷酸鈣顆粒粒徑較大且分布較寬，造成了其功能方面如基因轉染效率較低，重復性差［11］。反向微乳液法制備的磷酸鈣顆粒尺寸可控性好，但產量較低，從而也在一定程度上限制了其在臨床上的廣泛使用。He等［12－13］利用檸檬酸鈉與鈣離子的螯合作用，在共沉淀反應過程中引入檸檬酸鈉，合成了一種磷酸鈣納米顆粒，發現與鋁佐劑相比其可顯著促進HSV-2蛋白質抗原的免疫原性，刺激機體產生更高效價的抗體且對注射部位無刺激作用。同時，該磷酸鈣納米顆粒可刺激機體產生黏膜免疫反應，因此其可作為潛在的黏膜免疫佐劑保護機體免受病毒的感染。然而，該磷酸鈣納米顆粒是否可作為疫苗載體或佐劑提高DNA抗原的免疫原性則尚不清楚。筆者旨在通過評價該磷酸鈣納米顆粒的基因轉染能力，從而初步確定其是否可作為一種潛在的DNA疫苗載體或佐劑。

1 材料與方法

1．1 材料 293T細胞購自美國ATCC公司;DMEM細胞培養基、瓊脂糖、DNA分子量標準購于美國Thermo Fisher Scientific公司;增強型綠色熒光蛋白質粒DNA(pEGFP)購于美國Clontech公司;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購于美國Sigma公司;胎牛血清購自上海普飛生物技術有限公司，氯化鈣、磷酸二氫鈉、檸檬酸三鈉購于國藥集團化學試劑有限公司。

瓊脂糖凝膠電泳儀和凝膠成像儀購于北京六一生物科技有限公司;磁力攪拌器購于德國IKA公司;倒置熒光顯微鏡購于日本奧林巴斯株式會社;酶聯免疫檢測儀購于美國BioRad公司;流式細胞儀(BD Calibur)購于美國BD公司。

1．2 方法

1．2．1 磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復合物的制備與表征。將7．5 ml氯化鈣水溶液(12．5 mmol/L)加入玻璃瓶中，置于磁力攪拌器上。并在攪拌過程中，緩慢滴加7．5 ml磷酸二氫鈉水溶液(12．5 mmol/L)。向上述混合物中緩慢滴加1．5 ml檸檬酸鈉水溶液(15．6 mmol/L)，繼續攪拌約12 h。14 800 r/min，離心15 min。同時，將沉淀分散于1 ml去離子水中，利用馬爾文激光粒度儀對其粒徑和電勢進行表征［12－13］。

1．2．2 磷酸鈣納米顆粒的細胞毒性評價。設空白對照組(即培養基處理組)和磷酸鈣納米顆粒處理組。以0．25%胰酶消化293T細胞，終止消化后，以1 000 r/min，離心5 min。用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基制成單細胞懸液，并以5×104/ml濃度接種于96孔板中，每孔100μl。置于培養箱(37℃、5%CO2)中，繼續培養24 h。之后，棄去培養基，分別加入新鮮完全培養基和不同濃度梯度的磷酸鈣納米顆粒，磷酸鈣納米顆粒的工作濃度為 6．25、12．50、25．00、50．00和100．00μg/ml，置于培養箱中繼續孵育48 h。棄去培養基，并用磷酸鹽緩沖液輕輕洗滌2～3次。每孔加入120μl含適當濃度MTT的培養基，繼續培養4 h。最后，每孔加入150μl二甲基亞砜，置于搖床上，避光條件下，低速振蕩10 min。利用酶聯免疫檢測儀在490 nm處檢測吸光度，確定磷酸鈣納米顆粒的細胞毒性。

1．2．3 磷酸鈣納米顆粒基因轉染效率的評價。參照“1．2．1”方法制備磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復合物。具體方法:將100μg pEGFP質粒DNA溶于7．5 ml氯化鈣水溶液(12．5 mmol/L)加入玻璃瓶中，置于磁力攪拌器上。之后與“1．2．1”中所述方法完全相同，分別加入磷酸二氫鈉和檸檬酸鈉，反應12 h后，14 800 r/min，離心15 min。取上清，利用核酸分析儀檢測上清中游離質粒DNA的含量，從而確定磷酸鈣納米顆粒包裹DNA的效率。同時，將沉淀分散于1 ml無菌水中，最終獲得磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復合物(CAPNP-pEGFP)。

參照“1．2．2”方法，將293T 細胞懸液以5 ×104/ml濃度接種于24孔板中，置于培養箱(37℃、5%CO2)中，培養至對數生長期。棄去培養基，分別加入含游離pEGFP和磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復合物的完全培養基，pEGFP的工作濃度均為3μg/ml，繼續孵育48 h。利用倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀分別評價磷酸鈣納米顆粒的基因轉染能力。

2 結果與分析

2．1 磷酸鈣納米顆粒－pEGFP復合物的制備與表征 激光粒度儀的表征結果顯示，磷酸鈣納米顆粒的平均水合粒徑為692．6 nm，多分散系數(polydispersity index，PDI)為0．149，粒徑分布狹窄，表面電勢為－11．1 mV(圖1)。鈣離子可通過與DNA螺旋結構區的磷酸根形成復合物［14］，因此磷酸鈣納米顆粒可在沉淀反應過程中包裹質粒DNA即pEGFP。根據公式:

包裹效率(%)=(DNA總量－上清中游離DNA)/DNA總量×100

利用核酸分析儀，可以確定磷酸鈣納米顆粒對pEGFP的平均包裹效率為15．5%。總DNA與上清中游離DNA的電泳結果則進一步證明(圖2)，部分pEGFP可被磷酸鈣納米顆粒成功包裹起來。

2．2 磷酸鈣納米顆粒的細胞毒性評價 對磷酸鈣納米顆粒的細胞毒性作用進行評價。結果顯示，當材料處理細胞48 h，即使在高濃度(100μg/ml)，磷酸鈣納米顆粒依然未顯示出對293T細胞明顯的毒性作用，細胞活力仍在80%左右(圖3)。

2．3 磷酸鈣納米顆粒的基因轉染能力評價 由圖4和圖5可知，磷酸鈣納米顆粒可顯著提高pEGFP質粒DNA對293T細胞的轉染能力。這主要是由于游離DNA即pEGFP質粒DNA很難進入細胞且易被核酸酶降解，其對細胞的轉染能力很弱。而當磷酸鈣納米顆粒將其包裹后，可有效促進其進入細胞，同時保護其免受酶的降解。這意味著作為DNA疫苗載體，磷酸鈣納米顆粒可通過包裹DNA抗原，保護其免受降解，且促進其被組織細胞尤其是免疫細胞如樹突狀細胞攝 取，進而激活免疫細胞，提高抗原的免疫原性。

3 討論

該研究采用He等［12－13］合成磷酸鈣納米顆粒的方法，成功制備了粒徑分布狹窄的磷酸鈣納米顆粒，其對細胞未顯示出明顯的毒性作用，而且可有效促進pEGFP質粒DNA對293T細胞的轉染效率。這表明該磷酸鈣納米顆粒可能作為DNA疫苗的載體或佐劑，進一步提高抗原的免疫原性。下一步將對磷酸鈣納米顆粒與免疫細胞尤其是抗原呈遞細胞的相互作用，及其在動物試驗水平是否具有疫苗載體或佐劑的功能進行系統地研究。

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