正交法優(yōu)化廢次煙葉中水溶性多糖提取工藝

劉燮，羅健，張燕，田軍熊，譚小龍，涂云彪，陳波

(西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川西昌615013)

我國(guó)是世界煙草種植大國(guó)，年產(chǎn)煙葉300萬t左右，占世界總產(chǎn)量約40%。每年生產(chǎn)的煙葉中有20%～30%為廢次煙葉［1－2］，這些煙葉不能用做卷煙原料，若無合理利用途徑，將造成巨大的浪費(fèi)，也會(huì)造成環(huán)境的污染。廢次煙葉中含有多種活性化學(xué)成分，是生產(chǎn)保健品、食品、藥品、化妝品的重要原料［3－5］。因此，近年來廢次煙葉的綜合加工利用技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)，其中對(duì)于煙堿、綠原酸、茄尼醇等的提取純化工藝研究較多［6－10］，但對(duì)多糖提取技術(shù)研究仍較少［11－12］。多糖是植物體內(nèi)普遍存在的一類活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、降血壓等多種作用［13－16］。筆者以提取液中多糖含量為指標(biāo)，比較不同的提取條件對(duì)煙葉多糖提取率的影響，旨在為進(jìn)一步綜合利用廢次煙葉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 原料:廢次煙葉，2014年生產(chǎn)烤煙紅花大金元，由西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院提供。

主要試劑:濃硫酸、無水乙醇、蒽酮、硫脲、葡萄糖等試劑，均為分析純。

主要儀器:Q-506B2型高速多功能粉碎機(jī)，UNIVERSAL 320R型高速冷凍離心機(jī)，600型三用水箱，202-3A型電熱恒溫干燥箱，WP-RO-10型超純水機(jī)，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，1900PCS型雙光束紫外可見分光光度計(jì)等。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 原料預(yù)處理。將廢次煙葉置于60℃烘箱中烘干，將干燥后的煙葉除去煙梗，粉碎并過80目篩，于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 水提取工藝及正交設(shè)計(jì)。準(zhǔn)確稱取3 g預(yù)處理的煙葉粉末，放入200 ml三角瓶中，按照料液比(m/V)加入ddH2O，用玻璃棒攪拌均勻后，放入恒溫水浴箱中加熱，然后在4 000 r/min離心機(jī)中離心10 min，取上清液定容至100 ml，即得廢次煙葉多糖提取液。

選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素，各設(shè)4個(gè)水平(表1)，采用SPSSStatistics17．0的正交設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，得16個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4次，每次重復(fù)平行測(cè)定4次，以提取液中多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝，并進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

1．2．3 超聲提取工藝及正交設(shè)計(jì)。除加熱設(shè)備改為KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(超聲波功率為30 kHz，電功率為200 W)而外，其余流程同“1．2．2”。

正交試驗(yàn)選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素，各設(shè)4 個(gè)水平(表1)，設(shè)計(jì)方法同“1．2．2”。

1．2．4 酶法提取工藝及正交設(shè)計(jì)。在“1．2．2”的基礎(chǔ)上，處理體系中分別加入濃度為100 mg/ml的果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶各0．16 ml，放入恒溫水浴箱中加熱，其余工藝流程同“1．2．2”，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1．2．5 多糖含量測(cè)定。參照文獻(xiàn)，采用蒽酮－硫酸法測(cè)定［17］煙葉提取液中多糖含量，蒽酮試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，并加入硫脲做穩(wěn)定劑。

1．3 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 17．0軟件的一般線性模型單變量分析程序處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2．1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確取1 ml濃度分別為0．02、0．04、0．06、0．08、0．10、0．12、0．14、0．16、0．18、0．20 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞的試管中，再加入5 ml蒽酮試劑(立刻搖勻，并置于冰水浴中)，置沸水中水浴10 min，快速放入冰水浴中冷卻10 min，以蒸餾水為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)為626 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算線性回歸方程y=3．372 3x+0．215 3(R=0．965 6)。

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，根據(jù)蒽酮－硫酸法測(cè)定的多糖吸光度A，可以計(jì)算出反應(yīng)液中多糖的濃度C(mg/ml):C=(A －0．215 3)/3．372 3。

2．2 水提取工藝條件優(yōu)化 水提取工藝正交試驗(yàn)方差分析得出:F料液比=59．96＊＊，F(xiàn)提取溫度=46．72＊＊，F(xiàn)提取時(shí)間=7．54＊＊。由此表明，料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖的提取影響均達(dá)到極顯著水平。3個(gè)因素對(duì)多糖提取的影響程度大小依次為料液比、提取溫度、提取時(shí)間。

水提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果表明(表2)，料液比、提取時(shí)間和提取溫度的最佳工藝條件為A2B4C4，即料液比為1∶15 g/ml，提取時(shí)間為105 min，提取溫度為90℃。正交試驗(yàn)中，處理5(A2B1C2)，多糖含量最高，達(dá)到(9．02 ±0．50)mg/ml，其次為處理8(A2B4C1)，多糖含量達(dá)到(8．75 ±0．50)mg/ml，以及處理 6(A2B2C4)，多糖含量為(8．73 ±0．80)mg/ml。采用最佳工藝條件A2B4C4，進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證，提取液中多糖含量為(9．56±0．32)mg/ml，高于正交試驗(yàn)的最高處理。

2．3 超聲提取工藝條件優(yōu)化 方差分析得出，F(xiàn)料液比=224．04＊＊，F(xiàn)提取溫度=0．64，F(xiàn)提取時(shí)間=15．56＊＊。由此表明，在超聲提取工藝條件中，料液比和提取時(shí)間對(duì)結(jié)果影響極顯著，而溫度對(duì)多糖的提取影響不顯著。3個(gè)因素對(duì)多糖提取的影響程度大小依次為料液比、提取時(shí)間、提取溫度。

超聲提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果表明(表3)，料液比、提取時(shí)間和提取溫度的最佳工藝條件為A2B2C3，即料液比為1∶15 g/ml，提取時(shí)間為25 min，提取溫度為40℃。正交試驗(yàn)中，處理5(A2B1C3)多糖含量最高，達(dá)到(10．57 ±0．15)mg/ml;其次為處理8(A2B4C2)，多糖含量達(dá)到(10．54±0．14)mg/ml;以及處理6(A2B2C1)，多糖含量為(10．13 ±0．43)mg/ml。采用最佳工藝條件A2B2C3進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證，提取液中多糖含量為(10．61 ±0．22)mg/ml，略高于正交試驗(yàn)的最高處理。

表2 水提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 超聲提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2．4 酶法提取工藝條件優(yōu)化 由方差分析得出，F(xiàn)料液比=175．14＊＊，F(xiàn)提取溫度=0．62，F(xiàn)提取時(shí)間=2．03。由此可知，在酶法提取工藝條件中，料液比對(duì)結(jié)果影響極顯著，而溫度和時(shí)間對(duì)廢次煙葉水溶性多糖的提取影響不顯著。3個(gè)因素對(duì)多糖提取的影響程度大小依次為料液比、提取時(shí)間、提取溫度。

酶法提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，料液比、提取時(shí)間和提取溫度的最佳工藝條件為A1B1C2，即料液比為1∶10 g/ml，提取時(shí)間為50 min，提取溫度為40℃。在16個(gè)正交試驗(yàn)中，處理2(A1B2C3)多糖含量最高，達(dá)到(8．78±0．70)mg/ml;其次為處理3(A1B3C4)，多糖含量達(dá)到(8．31 ±0．35)mg/ml;以及處理1(A1B1C1)和處理4(A1B4C2)，多糖含量分別為(8．28 ±0．34)mg/ml和(8．27 ±0．30)mg/ml。采用最佳工藝條件A1B1C2進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證，提取液中多糖含量為(8．56±0．41)mg/ml，略低于正交試驗(yàn)的最高處理。

表4 酶法提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

多糖分子中含有大量羥基，具有較強(qiáng)極性，易溶于水，不溶于醇，因此利用此特性，采用水提醇沉法提取和純化多糖，是一種低成本、易操作、適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的常規(guī)方法。水提取法需要通過加熱來使細(xì)胞壁膨脹裂解，從而有利于細(xì)胞內(nèi)多糖的溶解。此外，還可以通過微波、超聲波等的機(jī)械作用破壞細(xì)胞壁，也可以添加果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶等分解細(xì)胞壁，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)多糖的溶出，從而提高提取效率。超聲波和酶都可以起到破壞細(xì)胞壁、釋放細(xì)胞內(nèi)容物的作用。當(dāng)超聲功率和作用時(shí)間足夠時(shí)，溫度的作用可以忽略，因此在一定的超聲條件下，反應(yīng)體系的溫度對(duì)提取效率的影響可能不顯著。酶具有生物活性，其活性程度具有最適溫度范圍，因此溫度在此范圍內(nèi)的變化對(duì)提取效率的影響都不顯著。

該試驗(yàn)分別采用水提取工藝、超聲提取工藝和酶法提取工藝提取廢次煙葉多糖。結(jié)果表明，超聲輔助工藝的提取效率最高，在最佳工藝條件下，提取液中的多糖含量可以達(dá)到(10．61±0．22)mg/ml;其次為水提取工藝，最佳條件下多糖含量可以達(dá)到(9．56±0．32)mg/ml;最后是酶法提取工藝，最佳條件下多糖含量為(8．56±0．41)mg/ml。3種工藝相比，超聲工藝提取效率最高，提取時(shí)間短、溫度低，但需要投入額外設(shè)備;水提取工藝提取效率居中，提取溫度最高，時(shí)間最長(zhǎng)，但條件簡(jiǎn)單，易操作;酶法提取效率最低，也需要輔助成本，但料液比低、溫度低、時(shí)間短。

水提取廢次煙葉多糖的最佳工藝條件為:料液比為1∶15 g/ml，提取時(shí)間為105 min，提取溫度為90℃，提取多糖含量為(9．56±0．32)mg/ml;超聲提取廢次煙葉多糖的最佳工藝條件為:料液比為1∶15 g/ml，提取時(shí)間為25 min，提取溫度為40℃，提取液中多糖含量為(10．61±0．22)mg/ml;酶法提取廢次煙葉多糖的最佳工藝條件為:料液比為1∶10 g/ml，提取時(shí)間為50 min，提取溫度為40℃，提取液中多糖含量為(8．56 ±0．41)mg/ml。

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