休閑鹵豆干中腐敗菌的分離鑒定

彭玲慧，吳菲菲，李化強，趙良忠，陳 浩，卜宇芳，劉 倩，李文強，徐緯，尹錦輝

(邵陽學院生物與化學工程系，湖南邵陽422000)

豆腐干是我國的傳統美食，其主要原料是大豆，富含蛋白質、不飽和脂肪酸、鈣及B族維生素，營養均衡，易被人體消化吸收［1］。豆腐干有鹵干、熏干、醬油干等，由于其營養豐富，含有大量蛋白質、脂肪、碳水化合物，還含有鈣、磷、鐵等多種人體所需的礦物質，有“植物肉”的美稱。休閑鹵豆干，是將豆腐干經過鹵制、調味、殺菌等工藝制成的口味多樣、營養豐富、適宜旅游休閑等的即食豆腐干食品。

近年來，隨著我國休閑食品的發展，休閑豆腐干以其良好的口感，在休閑食品市場越來越受消費者的歡迎，僅湖南邵陽地區在2014年豆制品產值就達30億元［2］。休閑豆腐干雖然產量在逐漸增加，但由于其富含蛋白質，營養豐富，很容易滋生微生物而導致腐敗變質［3］，再加上豆腐干加工的工藝復雜，生產周期長，因而與外界環境的接觸增加了微生物污染的機會;另外還有機械化程度低、手工操作多等因素，不同生產企業的加工環境和設施以及操作人員等差異［4］，導致生產過程中微生物污染更加難以控制，目前由微生物污染而導致豆制品腐敗的問題已成為制約豆制品大規模產業化的瓶頸之一［5］。因此，筆者以真空包裝腐敗變質的鹵豆干為研究對象，從中分離純化出優勢微生物，通過形態學特征、生理生化試驗及Sensititre微生物自動鑒定儀等方法鑒定真空包裝豆腐干中腐敗微生物，以期為休閑鹵豆干的生產能更好地控制該微生物的污染提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1．1 材料 供試原料:真空包裝鹵豆干，湖南恭兵食品有限公司。主要試劑:革蘭氏染液、甲醇、0．5%堿性復紅染色液、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、葡萄糖、氯化鈉、酵母浸膏等，均由邵陽學院生物與化學工程系實驗室提供。

主要儀器設備:高壓滅菌鍋(LDZX-75KB型)，上海申尖醫療器械廠;恒溫培養箱(HP X-9272MBE型)、電熱鼓風干燥箱(GZX-9140 MBE型)，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;G1200127N移液槍(1 ml和100μl)、EL20 pH計、電子天平(EL204)，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;恒溫水浴槽(SY-1210數顯)，上海柯維儀器有限公司;超凈工作臺(SW-CJ-1F)，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;自動快速微生物鑒定儀，英國SENSITITRE公司。

1．2 方法

1．2．1 腐敗菌的分離純化。在無菌條件下，取出已經脹包酸敗的鹵豆干，用無菌剪刀剪碎后，再用無菌鑷子夾取一小部分豆腐干加入到經高壓滅菌的LB培養基中，置37℃，120 r/min，搖床增菌培養12 h。10倍梯度稀釋至10－7，吸取100 μl菌懸液均勻涂布于營養瓊脂培養基，37℃培養18～24 h。挑取單個典型菌落接種于營養瓊脂培養基上，分離純化，得到純種。

1．2．2 形態觀察。觀察細菌菌落形態，挑取單個菌落，用火焰固定，進行革蘭氏染色，在顯微鏡下對細菌進行形態學觀察［6］。

1．2．3 腐敗菌的菌種鑒定。

1．2．3．1 富集培養。將分離純化后的純培養物接種于營養瓊脂培養基上，劃線培養，于37℃的恒溫培養箱中培養18～24 h。

1．2．3．2 濁度調整。取裝有標準接種液的濁度管，在濁度儀上調至100%，用滅菌棉簽挑取培養好的菌落，在無菌狀態下接種到濁度管中，測量，直到調至90% ～97%標準濁度值。

1．2．3．3 接種鑒定板。將調整好濁度的菌液倒入V型加樣槽，用移液器將菌液加入到微孔鑒定板上，于35℃條件下培養。

1．2．3．4 讀取數據。開啟鑒定系統，將已培養16～24 h的微孔鑒定板放到Sensititre微生物自動鑒定儀的讀數儀上，按照可能性大小給出1～2種可能菌株的名稱。

1．2．4 優勢腐敗菌相關生理生化試驗。根據Sensititre微生物自動鑒定儀鑒定出來的結果，結合GB 26427－2010對分離出的優勢腐敗菌進行MYP試驗、溶血試驗、動力試驗以及蛋白質結晶毒素試驗。

1．2．4．1 MYP試驗。挑取已分離純化的單菌落，劃線在甘露醇卵黃多粘菌素(MYP)瓊脂平板上，37℃培養18～24 h，觀察是否有粉紅色菌落且周圍有暈圈。

1．2．4．2 溶血試驗。挑選純化的菌落劃線，接種在血瓊脂平板表面，37℃培養(24±2)h，觀察菌落形態以及是否出現溶血環。

1．2．4．3 動力試驗。用接種針挑取選出的菌落穿刺接種于動力培養基中，37℃培養(24±2)h，觀察動力反應。

1．2．4．4 蛋白質結晶毒素試驗。取經37℃培養(24±2)h并于室溫放置2～3 d的培養物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混涂成薄膜。待自然干燥后用弱火固定。于涂膜處滴加甲醇，30 s后傾去甲醇，置火焰上干燥。接著滴加0．5%堿性復紅染色液，置火焰上加熱至微見蒸汽(勿使染液沸騰)后維持1．5 min，移去火焰，將載玻片放置0．5 min，傾去染液。用潔凈自來水徹底漂洗、晾干、鏡檢。在油鏡下觀察有無游離芽孢和深染的似菱形的小結晶體。

1．2．5 腐敗鹵豆干中菌落計數。根據GB 4789．2－2010，在無菌操作下，稱取腐敗變質豆腐干25 g，加入盛有225 ml滅菌生理鹽水中無菌均質杯內，8 000～10 000 r/min均質1～2 min。用1 ml無菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 ml，沿管壁緩慢注入盛有9 ml稀釋液的無菌試管中，制成1∶100的樣品勻液。重復以上步驟，制備10倍系列稀釋樣品勻液，梯度稀釋到10－7～10－1。選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，分別吸取1 ml稀釋液轉入到滅菌平皿中，每個稀釋度做2個平皿，同時，分別吸取1 ml空白稀釋液加入到2個無菌平皿內作空白對照。將涼至46℃的營養瓊脂培養基注入平皿約15 ml，轉動平皿使其混合均勻。將制好的平板置于(36±1)℃恒溫箱中培養(48±2)h后，觀察菌落生長和分布情況，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。

2 結果與分析

2．1 腐敗鹵豆干中細菌鑒定結果 從腐敗鹵豆干中分離出1株典型的菌落，命名為菌株A，將接種菌落的營養瓊脂平板置于37℃培養箱中培養18 h后，觀察平板上有典型的菌落生長。其菌落形態及細菌形態見圖1。腐敗豆腐干中細菌菌落和細胞顯微鏡形態如下:菌株編號為A，培養基為牛肉膏蛋白胨，90%以上的菌株為陽性反應，菌落形態近似圓形，有光澤，似蠟燭樣，菌落大，直徑5～7 mm，表面粗糙，扁平，細胞形態特征為G+，桿狀，末端方，呈短或長鏈。

根據試驗結果，從腐敗變質鹵豆干中分離出的菌株經分離純化后，進行革蘭氏染色，通過光學顯微鏡觀察，從顯微圖片可以明顯看到該菌為革蘭氏陽性菌，呈長桿狀。

2．2 Sensititre32型全自動細菌鑒定儀鑒定

2．2．1 A號菌株的鑒定結果。A號菌株的鑒定結果見表1。根據表1可以得出，A號鑒定板在培養18 h后，系統給出的最大可能結果是蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其PROB值為100%。

表1 A號菌株培養18 h后鑒定結果

2．3 生理生化試驗結果 根據Sensititre微生物自動鑒定儀鑒定出的結果，結合GB 26427－2010對分離出的菌種分別進行了MYP試驗、溶血試驗、動力試驗以及蛋白質結晶毒素試驗，結果見圖2～5及表2。根據形態觀察及生理生化測定結果，該分離菌株的生理生化結果與蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)相符。

表2 菌株A的生理生化特征

根據Sensititre微生物自動鑒定儀鑒定結果及相關生理生化試驗可以判斷該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

2．4 菌落計數 按照GB 4789．2－2010的要求，對腐敗鹵豆干中的細菌進行計數，經計算得出腐敗鹵豆干中的細菌數量是1．2 ×106CFU/g。

3 結論

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種在自然界廣泛分布的好氣性、產芽孢的桿菌，通常處于孢子和休眠的狀態。蠟樣芽孢桿菌一般不會致病，但有的菌株能導致食物中毒癥狀［7］，主要為腹瀉型和嘔吐型2種［8］。蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒是最常見的食物中毒之一，但目前各國并未強制要求檢測食品中蠟樣芽孢桿菌含量。

該試驗通過對分離細菌進行培養特性、生理生化特性以及Sensititre微生物自動鑒定儀鑒定，最后得出該分離的細菌為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

休閑鹵豆干是我國目前比較受廣大消費者喜愛的休閑食品，其豐富的營養價值及適宜的口感是其受消費者喜愛的主要原因。但是其在保存時期的受微生物污染而導致的腐敗脹包問題一直是影響休閑豆腐干生產和銷售的主要原因，而各地工廠由于生產環境及原料不同，導致影響豆腐干腐敗的微生物也不一定相同。因此，該研究結果可以為邵陽休閑鹵豆干生產中蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的控制采取針對性措施，從而延長貨架期，提高豆腐干的質量，為工廠在生產豆腐干過程中的防腐措施提供一定參考。

［1］陳金財．休閑豆制品行業現狀及未來發展方向［J］．農產品加工(創新版)，2009(7):52 －54．

［2］謝玲．休閑豆腐干行業突破短板放眼全國［J］．農產品加工，2012(7):8－9．

［3］王紅戟，陳婭，林沛璋．豆腐加工過程中微生物污染的調查與對策［J］．中國衛生檢驗雜志，2008(6):275．

［4］梁榮蓉，張一敏，李飛燕，等．雞肉調理制品生產過程中污染微生物的調查研究［J］．食品科學，2010(5):275．

［5］石彥國，任莉．大豆制品工藝學［M］．北京:中國輕工業出版社，1996:13－25．

［6］于源華．生物工程與技術專業實驗教程［M］．北京:化學工業出版社，2009:37－48．

［7］KOTIRANTA A，LOUNATMAA K，HAAPASALO M．Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections［J］．Micro Infect，2000(2):189－198．

［8］周幗萍，袁志明．蠟樣芽孢桿菌污染及對食品安全的影響［J］．食品科學，2007，28(3):357 －361．