嵌合雙串聯OVA T細胞表位的RHDV VP60蛋白免疫特性研究

宋艷華，張 燕，胡 波，范志宇，魏后軍，劉 星，黃 兵，薛家賓，徐為中，王 芳*

(1．江蘇省農業科學院獸醫研究所，農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京210014;

2．山東省農業科學院家禽研究所，山東濟南250023)

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種具有高度傳染性、高發病率、高致死性的疾病，是兔的一種毀滅性傳染病［1-2］。該病在世界各地都有發生，在歐洲和東亞地區呈地方性流行［3-5］。兔出血癥的病原RHDV是杯狀病毒的成員之一，屬于單鏈正股RNA病毒，基因組長約7．5 kb，其衣殼蛋白VP60可自行裝配形成VLPs(Virus-like particles)［6-9］，是 RHDV 結構及免疫原性研究的重點［10-13］。目前，已有大量研究表明VP60 VLPs可以作為外源表位遞呈載體和基因轉移載體，為其發展成為攜帶多表位的載體疫苗提供依據［14-18］。

為進一步擴展RHDV VLPs作為載體容納外源片段的長度以及作為載體有效遞呈外源T細胞表位的能力，筆者將外源雙串聯CD8+T細胞表位，序列為GSSIINFEKLGSSIINFEKLGS，按照以下方式分別整合到VP60序列中:將雙串聯OVA CD8+T細胞表位插入VP60 N末端;將雙串聯OVA CD8+T細胞表位序列分別替換VP60蛋白的2～13AA和302～309AA，通過桿狀病毒表達載體構建嵌合體，最終表達獲得3種嵌合蛋白，分別命名為 VP60-DN1、VP60-DN2 和 VP60-DC［19-20］。在上述研究的基礎上，筆者將獲得嵌合蛋白進行濃縮純化，選擇特異性的C57BL/6雌性小鼠進行免疫試驗，通過體液免疫應答和細胞免疫應答全面闡述VP60作為載體遞呈外源表位的能力，進一步證實VP60 VLPs具有作為疫苗載體的潛在價值。

1 材料與方法

1．1 試劑、病毒和實驗動物 重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60、rAcV-Bac-DN1、rAcV-Bac-DN2 和 rAcV-Bac-DC 由農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室構建并保存［2，19-20］。OVA CD8+T細胞表位多肽由吉爾生化公司合成;ELISPOT試劑盒購自Mabtech公司。7～8周齡C57BL/6雌性小鼠購自揚州大學比較醫學中心。

1．2 病毒樣顆粒的電鏡觀察 將重組桿狀病毒rAcV-Bac-VP60、rAcV-Bac-DN1、rAcV-Bac-DN2 和 rAcV-Bac-DC 接 種Sf9細胞，培養4～5 d待細胞完全病變后，分別收獲細胞培養物，3 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用PBS重懸洗滌3次后，反復凍融3次，12 000 r/min離心5 min，取上清，用作電鏡觀察。將待檢病毒培養物樣品滴于載樣銅網上，吸附作用2 min，將2%的磷鎢酸染液滴于銅網上，固定2 min。室溫干燥后用H-7650型透射電鏡對嵌合蛋白進行觀察。

1．3 嵌合蛋白的制備 將4種重組桿狀病毒分別以1%體積比接種于單層Sf9昆蟲細胞，培養4～5 d待細胞完全病變后，分別收獲細胞培養物，反復凍融3次后，5 000 g離心15 min去除細胞碎片，再次10 000 g離心30 min去除大的蛋白復合物和桿狀病毒粒子，上清中的VLPs再次100 000 g離心2．5 h進行濃縮，4℃PBS重懸沉淀，進一步通過蔗糖密度梯度離心進行純化，將樣品鋪于10% ～50%蔗糖上，100 000 g 4℃離心2 h，吸取分界面的樣品，再次超速離心100 000 g 4℃離心2 h除去蔗糖，沉淀用PBS重懸。利用BAC蛋白定量試劑盒測定純化后重組蛋白的濃度，最終獲得的重組蛋白分別命名為DN1、DN2、DC和VP60蛋白。

1．4 嵌合蛋白的免疫特性研究

1．4．1 動物免疫。將嵌合蛋白DN1、DN2、DC以及VP60蛋白分別免疫7～8周齡C57BL/6雌性小鼠，每組5只，共免3次，每次間隔2周，免疫程序見表1。設置相同注射體積的PBS組作為空白對照組。于首免后0、4和6周對所有小鼠尾部采血分離血清，采用建立的間接ELISA方法［21］檢測VP60特異性抗體滴度。于首免后6周將所有小鼠安樂死后分離脾淋巴細胞，用于檢測特異性IFN-γ分泌水平。

表1 動物實驗免疫程序

1．4．2 VP60特異性抗體效價的測定。首免后0、4和6周對所有小鼠尾部采血分離血清，采用間接ELISA法檢測各組小鼠血清中抗VP60的特異性抗體滴度。用pH 9．6包被液稀釋VP60蛋白，4℃下包被過夜。脫脂乳37℃下封閉2 h。洗滌后每孔加入倍比稀釋的待檢血清，100μl/孔，37℃孵育1 h。加入1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h。加入顯色液100μl/孔，避光作用10 min，最后加入終止液，50μl/孔。自動酶標儀測定OD450值，將P/N≥2．1即判定為陽性，計算抗體滴度。

1．4．3 ELISPOT檢測特異性IFN-γ分泌水平。首免后6周，將各免疫組小鼠處死取脾臟，分離脾淋巴細胞，用含10%胎牛血清RPMI-1640培養液稀釋細胞濃度為2．5×106個/ml。每組小鼠的脾淋巴細胞作3個重復孔，并設置非特異性刺激物ConA為陽性對照。ELISPOT檢測步驟為:用50μl/孔70%乙醇預處理ELISPOT板;棄去液體，無菌水洗滌5次;用無菌PBS(pH 7．4)稀釋包被IFN-γ 抗體(AN18)至15 μg/ml，每孔100μl，4℃包被過夜;棄去包被液，并用無菌PBS洗板5次;加入含10%胎牛血清RPMI-1640 200μl/孔，室溫孵育30 min。棄去細胞上清，加入含有2．5μg/ml OVA T細胞表位多肽刺激物的脾淋巴細胞懸液，200μl/孔。用錫箔紙包住板子置于37℃ 5%CO2培養箱，孵育48 h。48 h后棄去細胞液，PBS洗板5次;用0．5%FBS-PBS稀釋檢測抗體(R4-6A2-生物素)至1 μg/ml，100 μl/孔，室溫作用2 h。PBS 洗板5 次，用0．5%FBS –PBS1∶1 000 稀釋聯合親霉素-ALP，100 μl/孔，室溫作用1 h。PBS洗板5次，底物(BCIP/NBT-plus)用0．45μm的濾器進行過濾，100μl/孔，室溫作用直至出現斑點。用水沖洗即可終止顯色反應，將板子倒置晾干，室溫避光保存板子。利用ELISpot reader觀察并計數斑點。

2 結果與分析

2．1 嵌合蛋白的鑒定 電鏡結果表明，3種嵌合蛋白DN1、DN2和DC均可形成大小約為40 nm的VLPs，形態大小均與VP60蛋白VLPs相似(圖1)，說明VP60的2～13AA和302～309AA區域的改造不影響VP60 VLPs的形成。

2．2 VP60特異性抗體效價的測定 為檢測嵌合VP60蛋白免疫小鼠后誘導產生的體液免疫反應，分別于首免后0、4和6周采血分離血清，采用ELISA檢測各組誘導產生的特異性抗體效價滴度。從圖2可以看出，嵌合蛋白組以及VP60組誘導產生的特異性抗體效價滴度與PBS對照組差異極顯著(P＜0．001)。DN1、DN2、DC 和 VP60組免疫后與免疫前抗體效價差異極顯著(P＜0．001)，首免后6周，嵌合蛋白組與VP60組抗體效價均高于首免后4周的水平，且消長規律一致。嵌合蛋白組與VP60組之間抗體效價并無顯著性差異(P＞0．05)。這表明，重組蛋白免疫后能有高效地誘導機體產生抗VP60特異性抗體，且外源雙串聯T細胞表位的插入并未影響抗體產生的水平，嵌合蛋白有效地保持了VP60蛋白原有的免疫特性。

2．3 ELISPOT檢測特異性IFN-γ分泌水平 為了檢測嵌合蛋白中插入的雙串聯OVA T細胞表位能否誘發特異性細胞免疫應答，首免后6周分離免疫小鼠脾淋巴細胞，利用合成OVAT細胞表位多肽刺激淋巴細胞，ELISPOT檢測各免疫組小鼠脾臟淋巴細胞分泌特異性IFN-γ的水平。從圖3可以看出，VP60組無斑點產生，而3種嵌合蛋白組均顯示出一定數量的斑點，說明能夠誘導特異性IFN-γ的分泌，同時非特異性刺激劑ConA作為陽性對照，能夠誘導產生大量的IFN-γ的分泌。

將所有細胞孔中的斑點數據進行分析。從圖4可以看出，3種嵌合蛋白免疫小鼠脾淋巴細胞均能夠分泌特異性IFN-γ，且分泌水平顯著高于 VP60及 PBS對照組(P＜0．001)，其中DN1和DN2組分泌特異性IFN-γ的水平顯著高于DC組(P＜0．05)。該結果表明在VP60 N端插入外源T細胞表位與VP60 302～309AA相比，能夠誘導產生的細胞免疫應答更加強烈。

3 討論

在昆蟲細胞中表達RHDV VP60蛋白時，它能夠自發地形成形態學上和抗原學上與天然病毒無差異的病毒樣顆粒，其可以誘導機體產生中和抗體及有效的細胞免疫應答，不含有遺傳物質，能夠攜帶和有效遞呈外源片段，可以作為疫苗載體，為新型疫苗的研制提供基礎。Nagesha等［17］研究了對RHDV VP60的N-端和C-端進行缺失處理或用藍舌病毒衣殼蛋白VP7上的一個特征性的6個氨基酸殘基位點—Btag進行替換，結果表明在N-端插入外源序列不影響嵌合蛋白形成VLPs。E．Crisci［14］等在 VP60 的 N 端和 306AA 中插入單個OVA CD8+T細胞表位，結果顯示可形成嵌合的RHDV樣的病毒粒子，且可誘導強烈的細胞免疫應答。Khairunadwa Jemon等［22］將人通用輔助性T細胞表位PADRE插入VP60蛋白的N末端，并在形成的VLPs表面連接人乳頭瘤病毒E6蛋白中一小肽，該嵌合VLPs能夠對腫瘤小鼠的產生有效的免疫治療，并延長腫瘤小鼠的存活時間，研究表明VP60 N末端是一個良好的外源T細胞表位插入位點。在以上研究報道的基礎上，筆者選擇N端插入或替換為雙串聯OVA CD8

+T細胞表位的方式構建并獲得2種嵌合蛋白，且將302～309AA替換為串聯OVA CD8+T細胞表位構建并獲得一種嵌合蛋白，嵌合蛋白共攜帶外源片段的長度為22個氨基酸，通過嵌合蛋白的純化鑒定、動物免疫以及免疫后體液和細胞免疫應答的檢測分析，結果發現嵌合蛋白仍然具有形成VLPs的能力，且能夠誘導產生高水平的特異性細胞免疫應答，該試驗結果與相關報道結果一致，且進一步擴展了RHDV VP60作為載體容納外源片段的長度，驗證了VLPs具有高效遞呈外源T細胞表位的能力。

Xue Wang等通過低溫電鏡和晶體學技術解析RHDV的結構，發現VP60的300～318位氨基酸含有位于病毒粒子最外表面的Loop區［13］。該研究中選取的替換位點302～309AA包含在300～318位氨基酸中，位于P2亞單位突環處，且不包含保守氨基酸位點，故可能對外源基因的耐受性較高。該研究結果表明在VP60的N端和302～309位插入長達66 bp的外源片段后不影響VP60的自我組裝。

ELISPOT技術是一種國際公認的用于檢測特異性效應細胞分泌水平的方法。為檢測VP60作為展示系統遞呈外源OVA T細胞表位的能力，筆者在首免后6周分離脾淋巴細胞，利用ELISPOT方法進行檢測。結果表明，嵌合蛋白組均能誘導分泌特異性IFN-γ。該研究中VP60 N端插入外源T細胞表位的嵌合蛋白組比在VP60 302-309位插入外源表位的嵌合蛋白組引起的特異性細胞免疫應答能力更強，此結果與E．Crisci等的報道一致，進一步證實了N末端能夠更加有效的遞呈外源T細胞表位。

筆者利用前期構建的3種嵌合蛋白DN1、DN2和DC，進行動物免疫試驗，通過體液和細胞免疫應答檢測嵌合蛋白的免疫特性，結果表明3種嵌合蛋白均能引起針對載體VP60的特異性抗體應答;且能夠誘導特異性IFN-γ的分泌，其中DN1和DN2誘導的分泌水平高于DC組。這說明在VP60 N端插入外源T細胞表位比在VP60 302～309位插入表位引起的特異性細胞免疫應答能力更強。該研究結果擴展了VP60-VLPs作為載體容納外源片段的長度，同時進一步驗證了VP60-VLPs遞呈外源表位的載體效應。

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