樂清灣灘涂養殖貝類微生物富集及海水凈化研究

金 雷，陳雪昌，陳 瑜，劉 歡，郭遠明

(1．浙江省海洋水產研究所，農業部重點漁場漁業資源科學觀測實驗站，浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江舟山316100;

2．中國水產科學研究院，北京100000)

樂清灣位于浙江省中南部沿海，因為灘涂面積十分廣闊，加上近岸海水渾濁度大、泥質灘涂、有機質豐富等特點，是浙江省海水灘涂貝類養殖的主要產區［1-2］。其中，主要以養殖縊蟶(Sinonovacula constricta)、文蛤(Meretrix meretrix)、泥蚶(Tegillarca granosa)等濾食性雙殼貝類為主，其養殖面積和產量均占海水灘涂貝類養殖總面積和產量的80%以上。但是，近年來隨著樂清灣地區人口密集化程度的不斷提高，生活污水排放日益增多，使得部分養殖海域受到不同程度污染［3-5］。

貝類不僅營養豐富、滋味鮮美、價格低廉，而且富含牛磺酸，具有養生保健功能，因此深受消費者的青睞。然而，雙殼貝類屬于濾食性生物，在濾食餌料生物的同時，會將水體中的微生物吸入體內，食用病原微生物寄生的貝類極易引發疾病，從而暴發貝類中毒事件。為了保障消費者食用貝類產品衛生和安全，農業部漁業局和浙江省海洋與漁業局從2008年起就對樂清灣主要貝類養殖海區的環境狀況以及養殖貝類衛生狀況進行了分類管理工作。筆者通過對樂清灣不同品種灘涂養殖貝類的微生物進行抽樣檢測，掌握不同品種貝類對微生物富集能力的差異。同時，對貝類生長環境中的水體進行微生物檢測，確定生長水體對貝類富集微生物的影響程度。最后，通過水體凈化試驗，確定貝類微生物含量的增減規律。

1 材料與方法

1．1 采樣站位的設置 選擇樂清灣沿岸主要的海水灘涂貝類養殖區作為監測位點，共設置15個監測位點，其中溫嶺市5個，玉環縣5個，樂清市5個，具體監測位點如圖1所示。

1．2 主要儀器 隔水式恒溫培養箱(型號GHP-9270);智能光照培養箱(型號GXZ);生物安全柜(型號BSC-1000ⅡA2);立式壓力蒸汽滅菌器(型號YXQ-LS-50G);其他實驗室常用設備。

1．3 培養基及試劑 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯、EC肉湯(E．coli broth)、伊紅美藍(EMB)瓊脂、營養瓊脂、乳糖蛋白胨培養基、平板計數瓊脂、2216E瓊脂和HBI生化鑒定試劑盒等，均購自青島海博生物技術有限公司;其余均為實驗室常用試劑。

暫養的海水購自舟山市普陀區東河市場。海水理化特性如下:水溫24 ℃，pH 7．5，鹽度31．0 ‰，溶解氧6．75 mg/L，無色透明;細菌總數 ＜10 CFU/ml，糞大腸菌群＜20 MPN/L。

1．4 檢測方法

1．4．1 貝類大腸桿菌和菌落總數的檢測。大腸桿菌按照GB4789．38-2012食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數。將貝類撬殼稱取25 g肉，放入盛有225 ml磷酸鹽緩沖液中均質，制作成1∶10的樣品勻液。選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液)，每個稀釋度接種3管，然后放入培養箱中培養。經過初發酵、復發酵和生理生化試驗，計數陽性管數，查MPN表。

菌落總數按照GB4789．2-2010食品微生物學檢驗菌落總數測定。將貝類撬殼稱取25 g肉，放入盛有225 ml磷酸鹽緩沖液中均質，制作成1∶10的樣品勻液。然后，選擇合適的3個稀釋度，每個稀釋度做二個平板，用滅菌冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板翻轉，(30±1)℃培養(72±3)h。

所有試驗數據均為3次重復的平均值，試驗數據使用Excel軟件進行統計與分析。

1．4．2 海水中糞大腸菌群和細菌總數的檢測。參照GB17378．7-2007海洋監測規范第7部分近海污染生態調查和生物監測。糞大腸菌群采用發酵法測定，細菌總數采用平板計數法測定。所有試驗數據均為3次重復的平均值，試驗數據使用Excel軟件進行統計與分析。

1．5 凈化試驗方法［6］以縊蟶為研究貝類，采集樂清灣受污染較為嚴重的縊蟶，當天立即對縊蟶中大腸桿菌和菌落總數進行檢測，同時對縊蟶樣品進行暫養和凈化，暫養海水持續充氧，每隔24 h換水1次。此后每天換水前抽樣檢測縊蟶樣品中大腸桿菌和菌落總數，連續抽樣檢測5 d。

2 結果與分析

2．1 不同品種貝類對微生物富集能力研究 對樂清灣15個監測位點進行了3個批次的采樣檢測，樣品總數為45個。其中，縊蟶25個、文蛤10個、泥蚶10個。由表1可知，縊蟶中大腸桿菌的含量范圍為4 600～110 000 MPN/kg，菌落總數的含量范圍為1．2×104～3．9 ×105CFU/g，在抽檢的3個貝類品種中其數值范圍和上限最高。依據《農業關于印發2015年度海水貝類產品衛生監測和生產區域劃型工作方案的通知》(農漁發［2015］16號)文件，大腸桿菌數值為110 000 MPN/kg的貝類屬于第三類生產區(大于46 000 MPN/kg，且小于等于460 000 MPN/kg)，該區域生產的貝類產品須進行暫養或凈化，需達到二類生產區域(大于2 300 MPN/kg，且小于等于46 000 MPN/kg)貝類安全標準后方可上市。文蛤與泥蚶的大腸桿菌和菌落總數的含量范圍相近，二者沒有顯著差異。這2種貝類的大腸桿菌數值符合二類生產區域的要求，可上市但不可生食。

表1 不同品種貝類的微生物含量

2．2 貝類生長水體的微生物測定 為了研究貝類生長環境水質對其富集微生物的影響，分別選取溫嶺、玉環和樂清各1個貝類養殖位點，對該位點的海水中糞大腸菌群和細菌總數進行測定，并抽取5個相應位點的貝類樣品進行大腸桿菌和菌落總數檢測。由表2可知，海水中的糞大腸菌群和細菌總數含量越高，則該環境下生長的貝類中大腸桿菌和菌落總數就越高。因此，二者呈一定的正相關。海水是貝類生長的直接外界環境，海水中的微生物會直接影響貝類的細菌含量。

表2 貝類生長水體的微生物含量

表3 凈化試驗中大腸桿菌和菌落總數的檢測結果

2．3 凈化試驗 以縊蟶為研究貝類，樣品采集當天縊蟶中大腸桿菌的檢出值＞110 000 MPN/kg，菌落總數為3．1×105CFU/g，該貝類生產區屬于第三類生產區，該區域生產的貝類須進行暫養或凈化。凈化試驗每隔24 h換水1次，每天換水前進行抽樣檢測，連續抽樣5 d。由表3可知，凈化第1天縊蟶中大腸桿菌的檢測結果為46 000 MPN/kg，已符合二類生產區標準，可上市但不可生食。隨著暫養凈化時間的增加，縊蟶中大腸桿菌的數值也隨之減少，第3天大腸桿菌的檢測數值為2 300 MPN/kg，符合一類生產區標準，該區域生產的貝類產品可直接上市。第4、5天大腸桿菌的檢測數值小于300 MPN/kg，表明大腸桿菌已經很難被檢出。同時，菌落總數的檢出值也隨著暫養凈化時間的增加而減少，第5天菌落總數的檢出值為1．8×102CFU/g。

3 小結

筆者研究了不同品種貝類對微生物富集能力的差異，貝類生長環境水質對其富集微生物的影響和微生物污染貝類的海水凈化試驗。結果表明，在研究的縊蟶、文蛤、泥蚶樣品中縊蟶富集大腸桿菌和菌落總數的數值相對較高，文蛤和泥蚶富集能力沒有顯著性差異;海水中的糞大腸菌群和細菌總數含量越高，則該環境下生長的貝類中大腸桿菌和菌落總數就越高，二者呈一定的正相關;污染的縊蟶隨著暫養凈化時間的增加，縊蟶中大腸桿菌和菌落總數的數值也隨之減少。

［1］林志華，尤仲杰．浙江灘涂貝類養殖高產技術模式［J］．海洋科學，2005，29(8):95-99．

［2］朱秋華，錢國英．浙江省貝類養殖業可持續發展策略初探［J］．浙江萬里學院學報，2000，13(2):16-17．

［3］柴雪良，張炯明，方軍，等．樂清灣、三門灣主要濾食性養殖貝類碳收支的研究［J］．上海水產大學學報，2006，15(1):52-58．

［4］宋凱，郭遠明，梅光明，等．浙南主要養殖海域環境和貝類兩種重金屬含量調查研究［J］．水產科技情報，2014，41(3):120-123．

［5］陳雪昌，梅光明，郭遠明，等．浙江沿岸養殖貝類有毒有害物質污染狀況監測研究［J］．浙江海洋學院學報(自然科學版)，2011，30(1):40-45．

［6］鮑靜姣，郭遠明，金雷，等．受污染縊蟶大腸埃希氏菌的凈化研究［J］．廣州化工，2014，42(16):65-66．