急性持續(xù)熱應(yīng)激對成年兔血液部分生理生化指標(biāo)的影響

黃光遠(yuǎn)，趙 川，楊曉煉，趙 杰，潘芳燕，陽丹丹，黃慶洲

(西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶402460)

熱應(yīng)激是動(dòng)物在超出適宜溫度范圍的高溫環(huán)境中飼養(yǎng)時(shí)對熱應(yīng)激源所作出的非特異性生理反應(yīng)［1－2］。過度的熱應(yīng)激可使動(dòng)物的采食量、飼料報(bào)酬、抗病力和繁殖率等生產(chǎn)指標(biāo)顯著降低，甚至導(dǎo)致動(dòng)物大量死亡，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來極大危害［3］。在我國大部分地區(qū)，特別是西南地區(qū)，由于夏季高溫、高濕度持續(xù)時(shí)間長，環(huán)境溫度持續(xù)在30℃左右的時(shí)間長達(dá)3個(gè)月之久，熱應(yīng)激成為危害該地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖的重要環(huán)境因素之一［4］。對動(dòng)物熱應(yīng)激機(jī)制及如何降低其對養(yǎng)殖生產(chǎn)的影響已成為學(xué)術(shù)界重要的研究課題。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，熱應(yīng)激與機(jī)體交感－腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)及下丘腦－腺垂體－腎上腺皮質(zhì)機(jī)亢進(jìn)，腎上腺素、糖皮質(zhì)激素等分泌增多，引起一系列代謝紊亂，免疫及生殖機(jī)能、采食量降低等相關(guān)，對動(dòng)物生產(chǎn)性能帶來極大的負(fù)面影響［3］。關(guān)于急性持續(xù)熱應(yīng)激對動(dòng)物血液生理生化指標(biāo)的影響報(bào)道較少。筆者以成年健康肉兔為試驗(yàn)動(dòng)物，觀察了人工35℃、72 h持續(xù)熱應(yīng)激對成年動(dòng)物血液部分生理生化指標(biāo)的影響，以期為熱應(yīng)激機(jī)制研究提供基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要儀器。紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技有限公司，E-14-08-007)、電解質(zhì)分析儀(深圳市航創(chuàng)醫(yī)療設(shè)備有限公司，HC-9886)、自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)、SSW型電熱恒溫水槽(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)、低溫離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠制造)、－40℃低溫冰箱(海爾)、格力空調(diào)(珠海格力電器有限公司)、肝素鋰一次性真空采血管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)。

1．1．2 生化指標(biāo)測試藥盒。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)測試盒(批號分別為20140912、20140905)，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液、谷草轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液、2，4-二硝基苯肼液、丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液等;總膽固醇(TC)測試盒(批號為F0021-1)，主要試劑有膽固醇激酶、膽固醇氧化酶、過氧化物酶等;葡萄糖(Glu)測試盒(批號為F006)，主要試劑有對羥基苯甲酸鹽、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶 、4-氨基安替比林等;甘油三酯(TG)測試盒(批號為F001-1)，主要試劑有脂肪酶、甘油磷酸氧化酶、甘油激酶、ATP等;蛋白定量測試盒(批號為A045-2):考馬斯亮藍(lán)貯備液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品等。試驗(yàn)盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1．1．3 試驗(yàn)動(dòng)物。健康新西蘭肉兔16只，雄性，體重2．0～2．5 kg/只，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科提供。

1．1．4 動(dòng)物飼料。精深兔料860ZQA兔配合飼料(成都營大農(nóng)牧發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號20140624)。其中，粗蛋白≥16．0%、粗纖維 10．0% ～12．0%、粗灰分≤10．0%、粗脂肪≥2．0%、鈣0．5 ～1．0%、鈣磷比(%)2∶1、氯化鈉0．5%、水分≤12．5%、賴氨酸≥0．7%;飼料中主要微量元素含量為:Cu≤40 mg/kg、Fe≥80 mg/kg、Zn≥60 mg/kg;VA≥9 000 IU/kg、VD≥900 IU/kg、VE≥40 IU/kg。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物分組。試驗(yàn)時(shí)間安排在2014年7月7日至7月20日進(jìn)行，試驗(yàn)地點(diǎn)在西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物房。將16只健康兔移入普通立體兔籠飼養(yǎng)，每籠2只，自由采食和飲水，試驗(yàn)期間自然環(huán)境溫度27～32℃，常規(guī)飼養(yǎng)7 d，觀察采食和飲水無異常情況后，轉(zhuǎn)入正式試驗(yàn)。將動(dòng)物隨機(jī)分為熱應(yīng)激組(飼舍溫度控制為(35±1)℃)和適溫組(飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在(24±1)℃)，每組8只，每組單獨(dú)房間飼養(yǎng)。

1．2．2 飼舍溫度控制方法。熱應(yīng)激組:用200 W紅外線保溫?zé)襞菁訜幔谠囼?yàn)當(dāng)天8:00開始逐漸升溫，至當(dāng)天12:00飼舍溫度達(dá)到(35±1)℃(空氣濕度變化范圍為65% ～75%)，高溫持續(xù)時(shí)間72 h;適溫組:用空調(diào)降溫，于試驗(yàn)當(dāng)天8:00開始逐漸降溫，至當(dāng)天12:00飼舍溫度達(dá)到(24±1)℃(空氣濕度變化范圍為65% ～75%)，適溫持續(xù)時(shí)間72 h。

1．2．3 飼養(yǎng)方式及熱應(yīng)激處理時(shí)間。肉兔自由采食和飲水，每天8:00和18:00各飼喂1次，(35±1)℃熱應(yīng)激處理持續(xù)時(shí)間72 h。

1．2．4 血漿收集及保存。正式試驗(yàn)從早上8:00開始，每隔24 h后(即第2天早上8:00)，用肝素鋰真空采血管于兔的后肢外側(cè)靜脈采抗凝血5 ml，取1 ml抗凝血進(jìn)行血細(xì)胞數(shù)量測定，其他血液4℃、3 000 r/min離心5 min，收集血漿，分裝于1．5 ml指形管(0．5 ml/管)，－40 ℃保存，1 月內(nèi)待測。

1．2．5 血細(xì)胞數(shù)量的測定。采用自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血細(xì)胞數(shù)量的測定。

1．2．6 血漿電解質(zhì)含量的測定。采用臨床電解質(zhì)分析儀測定血漿電解質(zhì)含量。將低溫保存的血漿自然解凍，先用A標(biāo)準(zhǔn)液基點(diǎn)定標(biāo)，吸樣口吸取血漿125 μl，測定Na+、K+、Cl－和Ca2+的含量。

1．2．7 血漿生化指標(biāo)的測定。血漿GOT和GPT活性的測定采用賴氏法，以卡門氏單位作為酶的活性單位。卡門氏單位的定義:1 ml血清，反應(yīng)總?cè)萘? ml，340 nm波長，1 cm光徑，25℃、1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD而引起吸光度每下降0．001為1個(gè)卡門氏單位;血糖濃度采用葡萄糖氧化酶－過氧化物酶法測定，甘油三酯、血漿膽固醇含量的測定均采用酶偶聯(lián)比色法，血漿總蛋白溫的測定采用雙縮脲法。操作步驟按照試劑盒說明書的方法進(jìn)行。

1．2．8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS15．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 急性持續(xù)熱應(yīng)激兔血細(xì)胞數(shù)量的變化 由表1可知，急性持續(xù)熱應(yīng)激24 h后，熱應(yīng)激組白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)顯著高于或極顯著高于適溫組(P＜0．05或P ＜0．01)，淋巴細(xì)胞比率顯著低于適溫組(P ＜0．05);急性持續(xù)熱應(yīng)激48 h后，白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)顯著或極顯著高于適溫組(P＜0．05或 P＜0．01);急性持續(xù)熱應(yīng)激72 h后，血小板數(shù)、中性粒細(xì)胞比率顯著高于或極顯著高于適溫組(P＜0．05或P＜0．01)，而淋巴細(xì)胞數(shù)顯著低于適溫組(P＜0．05);其他指標(biāo)同一時(shí)間點(diǎn)各組間差異均不顯著(P＞0．05)。

表1 急性持續(xù)熱應(yīng)激兔血細(xì)胞數(shù)量的變化ˉx±s

2．2 急性持續(xù)熱應(yīng)激兔血漿部分生化指標(biāo)的變化 由表2可知，急性熱應(yīng)激處理24、48、72 h后，熱應(yīng)激組血糖含量與適溫組差異均不顯著(P＞0．05);血漿總蛋白熱應(yīng)激24 h后，熱應(yīng)激組顯著降低(P＜0．05)，熱應(yīng)激48、72 h后組間差異不顯著(P＞0．05);血漿甘油三酯和膽固醇的含量變化基本一致，熱應(yīng)激24、48、72 h后熱應(yīng)激組均顯著或極顯著高于適溫組(P＜0．05或P＜0．01);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的活性熱應(yīng)激24和48 h后顯著或極顯著低于適溫組(P＜0．05或P＜0．01)，熱應(yīng)激72 h后2組間差異不顯著(P ＞0．05);谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性熱應(yīng)激24、48、72 h后顯著或極顯著高于適溫組(P ＜0．05或 P ＜0．01)。

2．3 急性持續(xù)熱應(yīng)激兔血漿電解質(zhì)含量的變化 由表3可知，熱應(yīng)激組72 h后Na+含量極顯著低于適溫組(P＜0．01)，Cl－含量熱應(yīng)激24、48 h 后高于適溫組(P ＜0．05)，血漿游離鈣(iCa)含量熱應(yīng)激組48 h后顯著低于適溫組(P＜0．05);血漿 Na+、K+、Cl－、iCa2+含量其他時(shí)間點(diǎn) 2 組間差異均不顯著(P ＞0．05)。

3 討論

3．1 急性持續(xù)熱應(yīng)激對兔血細(xì)胞數(shù)量的影響 研究表明，在35℃持續(xù)熱應(yīng)激72 h內(nèi)，白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)呈先升高，然后恢復(fù)正常，淋巴細(xì)胞在前中期變化不大，72 h后呈降低趨勢，而整個(gè)試驗(yàn)期間血小板數(shù)均呈極顯著升高的趨勢;細(xì)胞比率變化方面，淋巴細(xì)胞比率早期降低，中后期恢復(fù)穩(wěn)定，中性粒細(xì)胞比率前中期基本穩(wěn)定，后期顯著升高。白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞作為機(jī)體防御免疫細(xì)胞，是機(jī)體非特異和特異性免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，急性持續(xù)熱應(yīng)激72 h內(nèi)引起其數(shù)量的變化趨勢，一定程度上說明急性熱應(yīng)激早期機(jī)體非特異免疫呈增強(qiáng)趨勢。但是隨著熱應(yīng)激時(shí)間的持續(xù)，特異免疫機(jī)能可能受到一定程度的抑制，其原因可能與隨著熱應(yīng)激的延長，腎上腺皮質(zhì)機(jī)能亢進(jìn)、糖皮質(zhì)激素分泌增加和抑制淋巴細(xì)胞的生成有關(guān)［5－6］。成年兔急性持續(xù)熱應(yīng)激72 h內(nèi)，血小板數(shù)量顯著升高，可能與兔處于急性高溫環(huán)境導(dǎo)致機(jī)體脫水及血液循環(huán)功能增強(qiáng)有關(guān)，但這種變化在熱應(yīng)激中的生物學(xué)意義有待深入研究。該試驗(yàn)中兔血細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢與其他報(bào)道［7－8］存在一定差異，可能與熱應(yīng)激的方式及持續(xù)時(shí)間長短有關(guān)。

表2 急性持續(xù)熱應(yīng)激兔血漿生化指標(biāo)的變化

表3 急性持續(xù)熱應(yīng)激兔血漿電解質(zhì)含量的變化

3．2 急性持續(xù)熱應(yīng)激對兔血液生化指標(biāo)的影響 研究表明，在35℃持續(xù)急性熱應(yīng)激72 h內(nèi)，兔血糖水平呈降低的趨勢，血漿總蛋白含量早期顯著降低，中后期趨于穩(wěn)定，血漿甘油三酯、膽固醇含量及GPT活性顯持續(xù)升高，而GOT活性呈降低趨勢。動(dòng)物處于急性持續(xù)熱應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體采食量降低，耗氧增加，分解代謝加快，能量釋放增加，導(dǎo)致血糖及血漿蛋白降低，說明在飲水或飼料中適當(dāng)添加葡萄糖及蛋白含量對于提高動(dòng)物抗熱應(yīng)激能力是必須的。甘油三酯和膽固醇是血脂的主要成分，血脂含量的高低反映了機(jī)體脂類代謝水平。該試驗(yàn)結(jié)果表明兔血漿甘油三脂及膽固醇含量熱應(yīng)激72 h內(nèi)持續(xù)升高，其原因可能是在熱應(yīng)激狀態(tài)下，由于動(dòng)物采食量下降，營養(yǎng)攝人不足，脂肪組織中脂肪的動(dòng)員作用加強(qiáng)，儲存在脂肪組織中的甘油三酯和膽固醇會快速釋放入血漿，導(dǎo)致甘油三酯和膽固醇含量的持續(xù)上升。該試驗(yàn)結(jié)果與劉梅等［9］的報(bào)道基本一致。谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和GPT主要存在于肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞內(nèi)，正常時(shí)其細(xì)胞內(nèi)濃度高于血清1 000～3 000倍，如GOT和GPT血清活性高于生理水平，往往表示肝細(xì)胞受損，臨床檢測血清GOT和GPT活性已成為解肝功能受損程度最敏感的檢測指標(biāo)［10］。該試驗(yàn)條件下GPT活性極顯著持續(xù)升高，說明急性持續(xù)熱應(yīng)激對肝臟有較

強(qiáng)的損傷效應(yīng)，其原因可能與熱應(yīng)激時(shí)機(jī)體耗氧增加，自由基生成增多，對肝細(xì)胞的損害加劇有關(guān)［11］，但GOT活性降低的原因還有待進(jìn)一步研究。有人認(rèn)為，這可能是短期熱應(yīng)激時(shí)胰島素分泌下降，使肌纖維等細(xì)胞膜的通透性降低，GOT釋放到血液的量減少的緣故［12］。

3．3 急性持續(xù)熱應(yīng)激對兔血漿電解質(zhì)的影響 該試驗(yàn)結(jié)果表明血清 Cl－含量增加，與劉思當(dāng)?shù)龋?3］和郭長江等［14］的報(bào)道基本一致，血清Cl－含量升高的原因除與采食量減少、飲水量增加有關(guān)外，還與急性熱應(yīng)激機(jī)體發(fā)生呼吸性堿中毒時(shí)，血液中的HCO3－進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與血清Cl－進(jìn)行交換，導(dǎo)致血清Cl－含量增加有關(guān);兔血漿游離鈣(iCa2+)濃度降低，與李建國［15］和 Teeter等［16］報(bào)道相似，其原因可能與動(dòng)物熱應(yīng)激時(shí)代謝性有機(jī)酸產(chǎn)生增加與Ca2+結(jié)合，從而導(dǎo)致血液中iCa2+濃度下降，也可能是熱應(yīng)激采食量降低，引起Ca2+攝入不足，干擾小腸粘膜上皮對Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)等原因所致［17］;Na+和K+是維持體液滲透壓、神經(jīng)肌肉興奮性及細(xì)胞外液容量的重要成分。該試驗(yàn)結(jié)果表明熱應(yīng)激24和48 h后血Na+和K+變化不明顯，但熱應(yīng)激72 h后Na+顯著降低，可能與機(jī)體較長時(shí)間采食量下降導(dǎo)致機(jī)體攝入量不足及機(jī)體通過汗液等其他途徑排出增多有關(guān)。這說明夏季高溫時(shí)適當(dāng)補(bǔ)充電解質(zhì)Na+和Ca2+等對于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和提高機(jī)體的抗熱應(yīng)激能力有重要作用。

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