三七重茬土壤中化感物質的提取及活性研究

母 丹，龍秀麗，鄭麗絲，王志遠，趙 靜*

(1．玉溪師范學院資源環境學院，云南玉溪653100;2．德宏師范高等專科學校，云南芒市678400)

三七(Panax notoginseng(Bruk)F．H．Chen)又名田七，五加科人參屬植物，是我國傳統的名貴中藥材。由于對環境要求的特殊性，三七主要集中分布于云南文山。三七是忌連作作物，一茬后土壤在幾年甚至幾十年內都不能再栽。其中一個重要的原因就是化感作用。

化感作用是指一個活體植物向環境釋放一些化學物質，影響周圍植物的生長和發育。這種作用包括促進和抑制兩種［1］。現已發現，植物可通過根系分泌、根茬腐解、莖葉淋洗、微生物代謝活動等途徑向環境中釋放化感物質［2］。Rice［3］把這些物質歸為14類，其中最常見的為低分子量有機酸、酚類和萜類化合物［4］。曾有報道表明，三七連作土壤對白菜、蘿卜、萵苣的種子和幼苗均有抑制作用。

通過采用不同的萃取劑及方法，對三七重茬土壤中的化感物質進行分離、提純，并且測定各組分對白菜種子萌發的抑制作用，初步明確三七化感物質活性組分的萃取條件，并且初步明確重茬土壤萃取液對三七病原菌的化感作用。

1 材料與方法

1．1 材料 供試土壤采自云南省文山州大丫口三七種植基地。在連作3年以上的三七地塊上采集土樣。各地塊處于相鄰位置，土壤理化性質基本一致。在每個地塊采用五點法采集三七根系下方土壤(0～20 cm)，混勻，共采集15分土樣。供試白菜種子為市售青島83-1。供試三七根腐菌(Fusarium solani)、三七疫病菌(Phytophthora cactorum)由云南農業大學植物病理實驗室提供。

1．2 方法

1．2．1 超聲萃取法。用萃取劑五倍量提取500 g土壤，于超聲清洗機中萃取，溫度為25℃，頻率為160次/min，2 h。旋轉蒸發儀濃縮，上XAD－4大孔吸附樹脂。用水及25%、50%和100%的萃取劑洗脫，分別收集各個濃度萃取劑的洗脫液，濃縮，定容至50 ml，置于4℃冰箱內備用。

1．2．2 振蕩萃取法。用萃取劑五倍量提取500 g土壤，然后25℃、160 r/min振蕩24 h。旋轉蒸發儀濃縮，上XAD－4大孔吸附樹脂。用水及25%、50%和100%的萃取劑洗脫，分別收集各個濃度萃取劑的洗脫液，濃縮，定容至50 ml，置于4℃冰箱內備用。

1．2．3 生物活性檢測。將提取物稀釋100倍液，加入底部鋪有一層濾紙的培養皿中。每皿放30粒預先用濃度0．5%高錳酸鉀消毒的白菜種子，恒溫培養箱中培養，溫度為25℃，濕度為70%，每24 h向各皿中加入2 ml左右蒸餾水以保持濕度。同時，每隔24 h記錄一次種子發芽數，以種子剛露芽為準，3 d后測量其根長。同時，以清水培養為陰性對照，以各萃取劑為陽性對照。

1．3 提取物對三七病原菌的化感作用 將提取的母液稀釋到100%、50%，經無菌過濾器過濾后，分別將不同濃度的浸提液與熔融狀態下的PDA培養基混合后倒入培養皿中。以浸提劑乙酸乙酯的平板為對照(CK1)，以不加任何物質的平板為空白(CK2)。

2 結果與分析

2．1 萃取方法對白菜種子萌發的抑制作用 分別采用2種萃取方法——超聲萃取法和振蕩萃取法，對三七重茬土壤的化感物質的活性組分進行萃取。由表1可知，4種萃取劑于25℃、160 r/min振蕩24 h萃取的活性組分對白菜種子的萌發抑制作用更強，說明該萃取方法能夠萃取到土壤中更多的活性組分。

2．2 不同萃取劑對白菜種子萌發、根長的影響 分別用乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、水4種萃取劑采用振蕩萃取法對三七重茬土壤的化感物質的活性組分進行萃取。將萃取到的活性組分對白菜種子進行生物活性檢測。由表2可知，乙酸乙酯、甲醇、正丁醇3種有機萃取劑萃取到的活性組分對白菜種子的萌發均具有抑制作用，且萃取劑的濃度越高，萃取到的活性組分抑制作用也越強。其中，100%乙酸乙酯萃取組分的抑制作用最強，培養皿中30粒種子均不萌發，萌發率為0;正丁醇居中;甲醇最弱。而水萃取到的物質對種子的萌發沒有抑制作用。

2．3 提取物對三七病原菌的化感作用 利用菌落的生長速率法，測定乙酸乙酯萃取液對三七根腐菌、三七疫病病菌的化感作用。由圖1、2可知，在作用時間為72 h時，濃度為100%處理的菌落直徑小于對照(CK1)和空白(CK2)。這說明乙酸乙酯萃取物質對三七根腐菌和疫病病菌有不同程度的化感抑制作用，且疫病病菌受到的化感作用更強，菌落直徑明顯小于對照。隨著濃度的減弱，抑制作用降低。當濃度為50%時，菌落直徑略微高于對照(CK1)和空白(CK2)。

表1 不同萃取方法對白菜種子萌發的抑制作用

表2 不同萃取劑對白菜種子萌發、根長的影響

3 討論

由于云南文山種植三七歷史悠久，且種植面積廣泛，三七連作障礙嚴重影響當地三七種植業的發展。目前，三七連作障礙的發生面積高達總種植面積的15%，每年由此造成的損失達上千萬元。連作障礙已成為三七栽培中亟待解決的難題［5］。現在，許多關于三七連作障礙的研究只是著手于病蟲害的治理與預防，很少研究其所具有的化感作用。

宋宇加［6］對栽培人參后土壤進行了化感物質的萃取、檢測。在經乙酸乙酯萃取的提取液中共鑒定出43種成分，而經甲醇萃取的提取液中只鑒定出7種。這表明乙酸乙酯能萃取到的活性組分更多。而試驗中3種萃取劑對白菜種子的萌發均具有抑制作用，且乙酸乙酯的抑制作用最強，萌發率為0。經乙酸乙酯萃取到活性物質為脂肪烷烴類、芳香烴類、酮類、醇類、酸類、酯類。但是，試驗中經乙酸乙酯萃取到的物質種類還有待進一步研究。

研究還表明，隨著萃取物濃度的降低，對三七病原菌的化感作用呈降低的趨勢。這與曹陽［7］試驗結果相似，與王樹桐［8］等在對番茄灰霉病等具有抗菌活性的植物浸提液的研究結果也是一致的。化感物質通常是多種成分共存的。化感作用是各類化感物質和環境各個因子如土壤、溫度、水、營養物質等綜合作用的結果，其中可能同時存在拮抗作用和協同作用［9］。

［1］HYDER PW，FERDRIEKSON EL，ESTELL R E，et al．Tnars port of Phenolic compounds from leaf surface of creosotebush and tarbush to soil surface by Preci pitation［J］．Journal of chemical ecology，2002，28(12):2475－2482．

［2］E·L·賴斯．天然化學物質與有害生物的防治［M］．胡敦孝，譯．北京:科學出版社，1988:19－28．

［3］RRCE E L．Allelopathy［M］．2nd ed．Orlando:Academic Press，1984．

［4］余叔文．植物間的相互作用:相生相克現象［M］//余叔文．植物生理與分子生物學．北京:科學出版社，1992:376－394．

［5］孫玉琴，韋美麗，陳中堅，等．化感物質對三七種子發芽影響的初步研究［J］．特產研究，2008(3):44－46．

［6］宋宇加．人參根系分泌物及土壤中化感物質的分離與鑒定研究［D］．長春:吉林農業大學，2008．

［7］曹陽．西芹腐根及腐根際區物浸提液對黃瓜枯萎病菌化感作用的研究［D］．呼和浩特:內蒙古農業大學，2009．

［8］王樹桐．對番茄灰霉病菌等具抗菌活性的植物浸提物的研究［D］．保定:河北農業大學，2001．

［9］宋麗．大蒜(Alliumsativum L．)鱗莖粗提物對西瓜和黃瓜枯萎病的抑制效應及其機理研究［D］．楊凌:西北農林科技大學，2006．