HPLC法測定油炸食品中TBHQ的方法學研究

杜曉楠，劉曉娥

（寧夏建投設計研究總院（有限公司），寧夏銀川 750000）

食品安全問題關系國計民生。其中，油炸食品中各種抗氧化劑特別是有機合成類抗氧化劑的合理使用，也是需要關注的問題[1]。當食品暴露在空氣中時，會發生不同的反應，而氧化反應會使暴露在空氣中的油脂發生變性，縮短保質期，特丁基對苯二酚（Tertiary Butylhydroquinone，TBHQ）可以和自由基發生反應，終止氧化過程，只需要添加少量就可以發揮有效作用。目前國家有關標準規定TBHQ的最大使用限量為0.2 g·kg-1[2]，過量添加對人體有一定的致癌作用。因此，加大對油炸食品中抗氧化劑的檢測尤為重要[3]。

目前市面上的抗氧化劑有人工抗氧化劑和天然抗氧化劑，天然抗氧化劑有從綠茶中提取的茶多酚、迷迭香的花和葉中提取的迷迭香，以及從植物中提取的維生素C、維生素E等。其中維生素、茶多酚等屬水溶性物質對油脂的抗氧化效果一般；維生素E有一定的抗氧化作用，但是提取工藝復雜，價格昂貴。油脂中常用的抗氧化劑是TBHQ，在食品中加入少量的TBHQ可以減緩油脂氧化作用，避免產生酸敗現象，使油炸食品能夠長時間保存。目前國家有關標準中對油炸食品中TBHQ的限量要求是不大于0.2 g·kg-1，在此范圍內對人體健康無害，超出范圍則可能存在導致畸形和癌癥的風險[4-5]。因此本實驗針對油炸食品中的TBHQ檢測研究建立了高效液相色譜法，旨在研究出一種快速、準確、靈敏度高的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

TBHQ標準品（≥99%），北京曼哈格科技生物有限公司；甲醇（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；正己烷（分析純），國家計量科學研究院；氯化鈉（分析純），廊坊天科生物科技有限公司；薯片，編號為1、2，市售；薯條，編號為1、2，市售；方便面，編號為1、2，市售。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（Aglient 1260 DAD），美國安捷倫科技有限公司；紫外分光光度計（TU-1810PC），北京普析通用儀器有限責任公司；超聲儀（As3120），天津奧特賽恩斯儀器有限公司；高速離心機（TGL-16G/TDL80），上海安亭科學儀表廠；分析天平（CP214），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；漩渦混勻器（MX-F），天津奧特恩斯儀器有限公司；固相萃取裝置（ASE-24），天津奧特賽恩斯儀器有限公司；旋轉蒸發儀（RE-52A），上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

TBHQ 儲 備 液（1 000 μg·mL-1）： 準 確 稱 取TBHQ標準品0.01 g（精確至0.1 mg），將其倒入棕色容量瓶中，用乙腈沖洗殘渣至10 mL容量瓶中并定容至刻度線，搖勻，配制成 1 000 μg·mL-1的儲備液，于0～4 ℃避光保存。

TBHQ工作液：分別吸取TBHQ儲備液（1 000 μg·mL-1）0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度線，配成 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1L、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1的標準工作液。

乙腈飽和的正己烷溶液：正己烷中加入乙腈至飽和狀態。正己烷飽和的乙腈溶液：乙腈中加入正己烷至飽和狀態。飽和氯化鈉溶液：水中加入氯化鈉至飽和。乙腈甲醇混合液：取100 mL的乙腈和50 mL的甲醇混合。

1.3.2 色譜條件的優化

取50 mL的潔凈離心管，加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，加入已知含量的TBHQ的儲備液，渦旋1 min，加入5 mL正己烷飽和的乙腈溶液，渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，收集下層清液，上機檢測，分別考察檢測波長、色譜柱種類、柱溫及進樣量、洗脫方式等因素對測定的影響，選出最佳的色譜條件。

1.3.3 樣品前處理

樣品的制備：將固體樣品粉碎，混合均勻，用四分法取具有代表的樣品，裝入容器，貼上標簽，密封保存。

提取：準確稱取1 g制備好的試樣于25 mL比色管中。加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，混勻1 min，然后加入5 mL飽和NaCl溶液，再加用5 mL飽和的乙腈溶液，渦旋2 min，4 000 r·min-1離心5 min，收集下層清液于離心管，上述操作2次，將3次提取液合并，然后凈化。

凈化：分別用5 mL的甲醇活化C18固相萃取柱，再用乙腈平衡萃取柱，將上述提取液液倒入柱中，棄去初濾液，用5 mL乙腈和甲醇的混合溶液洗脫。收集洗脫液于旋蒸瓶中，40 ℃下旋轉蒸發至干，用2 mL乙腈溶解殘渣，過0.22 μm有機微孔濾膜，供液相色譜儀測定，同時做空白實驗。

1.3.4 方法學驗證

篩選出合適的色譜條件后，在此條件下對高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定油炸食品中TBHQ的方法進行驗證，從線性、精密度、檢出限與定量限、樣品的測定等方面對該方法進行考察。

2 結果分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長

在180～1 200 nm波長范圍，用紫外分光光度計對TBHQ標準溶液進行光譜掃描，掃描后發現TBHQ在280 nm處吸光度最大，所以本次實驗選擇280 nm為TBHQ的檢測波長。

2.1.2 色譜柱的確定

本實驗分別用 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）和C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）兩種色譜柱進行實驗，發現 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜柱出峰時間早于 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，但分離能力不如 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，所以選取后者為本次實驗色譜柱。

2.1.3 柱溫

本次柱溫選擇30 ℃、35 ℃、40 ℃分別進行實驗，其中設置30 ℃接近室溫，到中午天氣升溫，屋內溫度大于柱溫，柱溫失效，不利于控制色譜柱溫度，設置40 ℃時，TBHQ目標峰與梯度洗脫出來的溶劑峰挨得過近，不利于分離目標化合物，最終實驗發現35 ℃時效果最佳。

2.1.4 進樣量

本次選擇 5 μL、10 μL、50 μL 3 個進樣量進行實驗，在進樣量為5 μL時，最低點的濃度出峰不明顯，低濃度值檢測不準確，在進樣量為50 μL時，色譜峰峰型過寬，容易包峰，導致檢測不準。最終發現10 μL時進樣效果最佳，所以確定柱溫為35 ℃、進樣量 10 μL。

2.1.5 洗脫方式

本實驗對梯度洗脫和等度洗脫進行對比實驗，發現采用梯度洗脫時，分離效果好、出峰速度快、采用等度洗脫時出峰時間較晚且分離度不如梯度洗脫，故選擇梯度洗脫為本次實驗條件，流動相為乙腈-水，梯度洗脫程序見表1。

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線

按照確定好的色譜條件，分別配制50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1和 400 μg·mL-1的標準工作液，將配制好的溶液裝入進樣瓶中，設置好色譜條件，依次上機檢測，以配制的濃度為橫坐標，所對應濃度的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到f（y）=0.002 8x+986、相關性系數為0.999 9的線性回歸方程，線性范圍 50～ 400 μg·mL-1，見圖1。

圖1 TBHQ校準曲線圖

2.2.2 精密度

選取薯片作為基質樣品，稱取7份，其中一個為空白樣品，剩下6個分別編號1～6分別加入0.6 mL 的標準儲備液（1 000 μg·mL-1），按照樣品處理步驟，進行樣品處理，然后上機檢測，在減去空白值后所測得含量值分別為 201 mg·kg-1、203 mg·kg-1、202 mg·kg-1、200 mg·kg-1、201 mg·kg-1、202 mg·kg-1，精密度為0.52%，實驗精密度小于2%，實驗結果良好。

2.2.3 回收率

稱取18份粉碎好的薯片，分為低中高3組，每組6個，分別按表2中的添加量加入對應濃度的儲備液，然后按照確定好的方法進行前處理，最后上機檢測。實驗結果表明薯片中TBHQ的回收率為96%～98%，相對標準偏差（RSD）不大于2%，實驗結良好，表明方法可靠.

表2 加標回收率試驗數據

2.2.4 檢出限和定量限

檢出限和定量限結果如表3所示。

表3 檢出限定量限結果

2.2.5 樣品的測定

對市場上銷售的薯片、方便面、薯條按照所建立方法進行測定，檢測產品是否符合國家標準。由表4的數據可知，市面上常見的油炸食品TBHQ均未檢出，產品合格。

表4 樣品測定結果

3 結論

本文建立了HPLC法測定油炸食品中TBHQ樣品預處理方法，采用 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，檢測波長為280 nm，以乙腈和水作為流動相，采用梯度洗脫方式，柱溫35 ℃，進樣量為10 μL，選取正己烷去油脂，乙腈提取，C18固相萃取柱凈化，紫外檢測器檢測，外標法定量，得到TBHQ平均加標回收率為97%，精密度為0.52%，檢出限為0.26 μg·mL-1，定量限為 0.79 μg·mL-1。該方法快速、準確、靈敏度高，具有推廣應用價值。