阿托伐他汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡的影響*

朱 丹，胡 瑩，趙 欣，馬吉芳，郝建兵，任連生，崔 蕾(.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)二病房 50070；.黑龍江省醫(yī)院血液透析中心，哈爾濱 5000)

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阿托伐他汀對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡的影響*

朱 丹1，胡 瑩1，趙 欣2，馬吉芳1，郝建兵1，任連生1，崔 蕾1(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)二病房 150070；2.黑龍江省醫(yī)院血液透析中心，哈爾濱 150001)

目的 探討不同濃度阿托伐他汀對(duì)大鼠系膜細(xì)胞凋亡的影響。方法 體外培養(yǎng)大鼠永生系膜細(xì)胞，分為5組：對(duì)照(C)組；高糖(30 mmol/L)(H)組；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-7mmol/L)(H+A1)組；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-6mmol/L)(H+A2)組；高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-5mmol/L)(H+A3) 組。采用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。采用caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)系膜細(xì)胞caspase-3活性。結(jié)果 與C組相比，H組系膜細(xì)胞凋亡率明顯增加，caspase-3活性明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與H組相比，高糖加不同濃度阿托伐他汀組細(xì)胞凋亡率明顯降低，caspase-3活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴。結(jié)論 阿托伐他汀可以通過caspase途徑抑制醛固酮誘導(dǎo)的大鼠系膜細(xì)胞凋亡。

阿托伐他汀； 高糖； 系膜細(xì)胞； 凋亡； caspase-3

糖尿病腎病(DN)的特點(diǎn)為早期出現(xiàn)微量蛋白尿，后期出現(xiàn)大量蛋白尿，嚴(yán)重DN可發(fā)展成尿毒癥。由于DN的嚴(yán)重致殘性，越來越多的學(xué)者開始致力于對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究。Abboud[1]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟系膜細(xì)胞的凋亡與蛋白尿的多少關(guān)系密切。因此本研究推斷系膜細(xì)胞的凋亡參與了DN的發(fā)生和發(fā)展。Danesh和Kanwar[2]研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了具有降脂作用外，還具有其他方面的作用，如抗氧化應(yīng)激作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，減少炎癥等。本研究擬探討他汀類藥物對(duì)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡的影響，從而揭示DN發(fā)生的分子機(jī)制，深入探討阿托法他汀保護(hù)腎臟的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 系膜細(xì)胞由上海長(zhǎng)征醫(yī)院梅長(zhǎng)林教授贈(zèng)送；阿托伐他汀為美國(guó)輝瑞公司生產(chǎn)的立普妥；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒由北京寶賽生物公司生產(chǎn)；caspase-3活性檢測(cè)試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。

1.2 分組 對(duì)照 (C) 組,高糖(30 mmol/L)(H)組,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-7mmol/L)(H+A1)組,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-6mmol/L)(H+A2)組,高糖(30 mmol/L)+阿托伐他汀(10-5mmol/L)(H+A3) 組。各組細(xì)胞加藥后培養(yǎng)24 h。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 caspase-3活性檢測(cè) 按碧云天caspase-3試劑盒說明書中步驟，迅速測(cè)定caspase-3的酶活性。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)系膜細(xì)胞凋亡率 采用Annexin V-FITC和PI雙染法將樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞區(qū)分開。采用的判定標(biāo)準(zhǔn)為:左上象限PI(+)、AnnexinV(-)表示壞死細(xì)胞區(qū);左下象限PI(-)、AnnexinV(-)表示活細(xì)胞區(qū)；右上象限PI(+)、Annexin V(+)表示凋亡晚期或死亡細(xì)胞區(qū);右下象限PI(-)、AnnexinV(+)表示早期凋亡細(xì)胞區(qū)。

2 結(jié) 果

阿托伐他汀對(duì)caspase-3活性和系膜細(xì)胞凋亡率的影響 見表1。與C組相比，H組caspase-3活性明顯增高，為(16.29±1.01)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，H+A1組為(12.37±1.02)%，H+A2組為(9.25±0.92)%，H+A3組為(6.26±0.45)%，均較H組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈濃度依賴。C組阿托伐他汀對(duì)系膜細(xì)胞凋亡率為(2.71±0.24)%,H組為(20.05±0.21)%，H+A1組為(16.45±0.45)%，H+A2組為(12.31±0.33)%，H+A3組為(7.25±0.73)%。高糖可以誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡，而阿托伐他汀可以抑制系膜細(xì)胞凋亡，且其作用呈濃度依賴。

表1 各組caspase-3活性和系膜細(xì)胞凋亡率比較

注：與C組相比，*P<0.05；與H組相比，#P<0.05；與H+A1組相比，△P<0.05；與H+A2組相比，▲P<0.05。

3 討 論

細(xì)胞凋亡可能會(huì)引起系膜細(xì)胞減少，增加尿蛋白漏出，從而最終導(dǎo)致腎小球硬化[3];而腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化，可以由腎小管上皮細(xì)胞凋亡引起，造成尿蛋白加重，最終損害腎功能[4]。近些年，隨著人們對(duì)腎臟細(xì)胞凋亡研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與DN的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

許多學(xué)者研究表明，他汀類藥物可以減少尿蛋白排泄，延緩糖尿病患者腎小球?yàn)V過率下降，減少腎小球硬化速度，從而延緩DN的進(jìn)展，起到腎臟保護(hù)作用[5]。

Zhou 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可以通過減少線粒體融合蛋白2的表達(dá)來抑制心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。Nam 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀可以通過smad依賴性通路及smad非依賴性通路減少環(huán)孢素腎病模型大鼠腎臟細(xì)胞的凋亡，抑制炎癥，減輕腎臟纖維化。Ishibashi等[8]研究表明，普伐他汀可以通過減少晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，從而抑制近端腎小管細(xì)胞凋亡。Copaja 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以通過Rho依賴機(jī)制誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞凋亡。Lavi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞在高膽固醇豬的腎臟中可以凋亡，但辛伐他汀可以減少高膽固醇血癥引起的細(xì)胞凋亡，從而減少腎臟損傷，起到腎臟保護(hù)作用。Cormack-Aboud等[11]研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀可以通過P21依賴性抗凋亡通路抑制足細(xì)胞凋亡，從而減少足細(xì)胞損傷，減少尿蛋白，保護(hù)腎臟。Lin 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可以通過調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡。Bussolati等[13]研究表明，他汀類藥物可以減少氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，也可以減少腎小球足細(xì)胞膜裂空蛋白丟失，其作用可能是通過Akt通路實(shí)現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)，高糖作用于腎小球系膜細(xì)胞引起凋亡的同時(shí)，可引起caspase-3活性增加，表明高糖是通過活化caspase引起系膜細(xì)胞凋亡的，而阿托伐他汀可以通過抑制caspase活化減少系膜細(xì)胞凋亡，且隨著阿托伐他汀濃度增加，其抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞凋亡作用逐漸加強(qiáng)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，高糖引起caspase-3活化，從而誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞凋亡，而高糖的上述作用可以被阿托伐他汀所抑制，且呈濃度依賴性。

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Effect of atorvastatin on apoptosis of hyperglycemia induced mesangial cells in rat*

ZHUDan1,HUYing1,ZHAOXin2,MAJi-fang1,HAOJian-bing1,RENLian-sheng1,CUILei1

(1.SecondDepartmentofNephrology,FirstAffiliatedHospitalofHaerbinMedicalUniversity,Haerbin,Heilongjiang,150070,China;2.HemodialysisCenterCenter,HeilongjiangProvincialHospital,Haerbin,Heilongjiang150001,China)

Objective To investigate the influence of different concentrations of atorvastatin on apoptosis of rat mesangial cells.Methods Rat immortal mesangial cells were cultured in vitro and divided into 5 groups:control(C) group,hyperglycemia (30 mmol/L,H)group,hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-7mmol/L)(H+A1) group,hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-6mmol/L)(H+A2)group and hyperglycemia (30 mmol/L)+atorvastatin(10-5mmol/L)(H+A3)group.Apoptosis was detected by Annexin V-FITC and PI double staining,and the caspase-3 activity was assayed by the caspase-3 activity kit.Results Compared with the group C,the mesangial cells apoptosis rate and caspase-3 activity in the group H were significantly increased,the differences were statistically significant(P<0.05).Compared with the group H,the mesangial cells apoptosis rate and caspase-3 activity in the H+A1,2,3 groups were significantly decreased,the differences were statistically significant(P<0.05),moreover which showing the concentration dependence.Conclusion Atorvastatin may inhibit aldosterone induced mesangial cells apoptosis via caspase pathway.

atorvastatin; high glucose; mesangial cells; apoptosis; caspase-3

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12521293)。

朱丹，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事糖尿病腎病腎纖維化研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.007

A

1672-9455(2015)09-1196-02

2014-11-11

2015-01-25)