miR-34c對膠質瘤細胞增殖、凋亡和細胞周期影響的實驗性研究

武震東，任洪波，孫志強，劉 斌，牛國棟，焦保華

（1.河北醫科大學第二醫院神經外科，河北 石家莊050000；2.河北省邯鄲市中心醫院神經外科，河北 邯鄲056000）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種約22個核苷酸長度非編碼單鏈小RNA，其本身不具有翻譯蛋白質的功能，通過與mRNA的3′端非翻譯區（3′UTR）堿基序列互補配對在轉錄后水平調控靶基因表達。miRNA與mRNA能進行完全或近乎完全的互補配對，誘導對mRNA的切割降解，而部分堿基配對則導致功能蛋白質的轉錄抑制［1］。最近有報道miRNA與腫瘤惡性程度及腫瘤患者的預后有密切關系［2］。亦有報道與正常組織比較，惡性腫瘤組 織 的 miRNA 異 常 表 達［3］。MicroRNA-34c（miR-34c）在膠質瘤組織中廣泛低表達，且隨膠質瘤級別的升高，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達顯著降低，miR-34c-3p和miR-34c-5p表達與膠質瘤級別呈負相關。本研究為膠質瘤細胞系U251和U87細胞轉染miR-34c-3p和miR-34c-5p，上調其表達，檢測miR-34c對人腦膠質瘤細胞增殖、細胞周期、凋亡等生物學特性的影響，旨在為膠質瘤的治療開拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株 膠質瘤細胞系U251和U87細胞購于中國科學院細胞庫。正常人膠質細胞系HEB細胞購自中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 U251用含10%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）的 DMEM-F12培養基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培養基培養，將符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5%CO2的培養箱內24～48h后換液繼續培養，換液的時間由細胞貼壁情況而定。培養U251、U87、HEB細胞達到指數生長期進行實驗。利用脂質體介導的轉染方法，將化學合成的miR-34c寡核苷酸轉染到膠質瘤U87和U251細胞中，同時設立轉染非特異性寡核苷酸片段的陰性對照組，使miR-34c基因有效的過表達。將未轉染任何核苷酸鏈的膠質瘤U87和U251細胞為空白組。

1.2.2 細胞轉染miRNA 轉染采用脂質體轉染試劑LipofectamineTMRNAiMAX轉染試劑，用LipofectamineTMRNAiMAX轉染miRNA（化學合成的成熟miRNA模擬物mimics濃度為50nmol／L）到細胞內，轉染時使用Opti-MEM培養基，轉染后4h換為細胞生長培養基（U251用含10%FBS的DMEM-F12培養基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培養基）。

1.2.3 定量PCR檢測轉染效果 利用RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen，USA）提取收集細胞總RNA。取1μg總RNA做莖環引物的逆轉錄反應。miR-34c-3p和miR-34c-5p的共同逆轉錄引物為miRNA R：5′CTCAACTGGTGTCGTGGA。PCR引物為 hsa-miR-34c-3p F：5′ACACTCCAGCTGGGAATCACTAACCACACGG；hsa-miR-34c-5p F：5′ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTGAT。內參U6的引物為U6-F：5′CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R：5′AACGCTTCACG-AATTTGCGT。所有引物均為上海生工生物工程公司合成。使用的定量PCR儀為ABI PRISM?7500Sequence Detection System。PCR擴增程序如下：95℃變形5min，隨后95℃作用15s，65℃作用15s，72℃作用32s，共進行40個循環，在溫度60～95℃進行融解曲線分析，每個樣本重復3次。

1.2.4 細胞增殖-毒性檢測（Cell Counting Kit-8，CCK-8）法檢測細胞增殖能力 取轉染后細胞進行下面實驗。吹打散細胞，調整細胞濃度為1×105個／mL，分到96孔板，每孔100μL，即每孔細胞為1×104個。等細胞半貼壁完全，收集各個時間點的細胞24、48、72、96h加入CCK-8溶液細胞增殖檢測試劑，比例為1∶10。即100μL培養液加入10μL檢測液。在孵育4h后，酶標儀讀板光密度（optical delnsity，OD）490數據。細胞存活率＝OD轉染組／OD對照組。

1.2.5 細胞周期檢測 細胞轉染48h后每樣收集1×106細胞。離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞2次，加入預冷70%乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定。離心收集細胞，以1mL的PBS洗細胞1次，加入500μL PBS含50μg／mL溴化丙錠（propidiumiodide，PI），100μg／mL核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A），0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），4℃避光孵育30min。以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數2～3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

1.2.6 細胞凋亡檢測 細胞轉染48h后，將細胞培養板中各組細胞的培養基分別轉移到15mL的錐形管中并置于冰上。用2mL PBS溶液輕輕潤洗培養板內細胞，去除PBS溶液，加入0.5mL 0.25%不含EDTA的胰酶孵育，直到顯微鏡下觀察到細胞開始從培養板壁脫落。輕輕連續拍打使細胞從培養板壁上完全脫落，將細胞輕輕重懸于預冷的1×結合緩沖液中使得其密度為1×106細胞／mL，將0.5 mL細胞懸液從細胞培養板中（5×105個細胞）轉移到1個干凈的離心管內，加入1.25μL細胞凋亡檢測試劑Annexin V-FITC，室溫（18～24℃）避光反應15min，室溫1 000g離心5min，去除上清，將細胞用0.5mL預冷的1×結合緩沖液輕輕重懸，加入10μL PI，立即用流式細胞儀檢測分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析、LSD-t檢驗和重復測量設計資料的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 定量PCR檢測miR-34c-3p和miR-34c-5p的轉染效果 在U87和U251細胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達量要明顯小于正常膠質細胞系HEB（圖1，2）。而轉染了 miR-34c-3p或 miR-34c-5p的U87和U251細胞，其miR-34c-3p的表達量明顯高于空白組（P＜0.05，圖1）和陰性對照（P＜0.05）。該結果確定了miRNA確實轉染成功。

2.2 轉染miR-34c抑制膠質瘤細胞的增殖能力在U251細胞中，轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96h，細胞存活率顯著低于空白組（P＜0.05）和陰性對照組（P＜0.05）（圖3）。而在 U87細胞中情況有所不同，轉染miR-34c-3p后48、72、96h，細胞存活率顯著低于空白組（P＜0.05）和陰性對照組（P＜0.05）；轉染 miR-34c-5p后24、48、72、96h，細胞存活率顯著低于空白組（P＜0.05），而與陰性對照組差異無統計學意義（P＞0.05）（圖4）。

2.3 轉染miRNA-34c后細胞周期的變化 在U251細胞中，空白組和陰性對照組細胞的G0／G1期分別占72.7%和73.44%，而轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其 G0／G1期分別降至44.24%和43.58%。而空白組和陰性對照組細胞的G2／M期分別僅占4.4%和4.31%，轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其G2／M期分別升至21.6%和21.83%。S期與G2／M期相似，轉染后所占比例上升（圖5）。在U87細胞中，空白組和陰性對照組細胞的G0／G1期分別占69.3%和75.62%，轉染miR-34c-3p后，其G0／G1期降至44.05%，而轉染miR-34c-5p卻不能影響G0／G1期（79.07%）。空白組和陰性對照組細胞的S期分別占20.66%和13.61%，轉染miR-34c-3p后，其S期升至48.83%，但轉染miR-34c-5p同樣不能影響S期（11.04%）。G2／M期在4組中所占比例差異無統計學意義（圖5）。該實驗證實了U251細胞高表達miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87細胞高表達miR-34c-3p可以導致細胞停滯在S期，同時降低了G0／G1期的細胞數。細胞周期的變化說明miR-34c可能通過抑制細胞周期中的某個通路以達到抑制細胞增殖的目的。

2.4 轉染miRNA-34c后誘導膠質瘤細胞的凋亡

根據流式細胞儀的結果，Annexin V和PI雙陽性的細胞即為凋亡細胞。在U251細胞中，凋亡細胞在空白組和陰性對照組分別占6.57%和6.3%，而轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡細胞所占比例上升分別占28.49%和28.14%。但是在U87細胞中有所不同，僅轉染miR-34c-3p后凋亡細胞數上升（3.56%），而空白組，陰性對照組和轉染miR-34c-5p組分別為1.53%，1.68%和1.91%（圖6）。

圖1 實時定量PCR檢測正常膠質細胞系HEB、U251和U87細胞系中miR-34c-3p的表達＊P＜0.05為miR-34c-3p組與空白組比較 ＃P＜0.05為miR-34c-3p組與陰性對照組比較 △P＜0.05為空白組與HEB比較（LSD-t檢驗）

圖2 實時定量PCR檢測正常膠質細胞系HEB、U251和U87細胞系中miR-34c-5p的表達＊P＜0.05為miR-34c-5p組與空白組比較 ＃P＜0.05為miR-34c-5p組與陰性對照組比較 △P＜0.05為空白組與HEB比較（LSD-t檢驗）

圖3 轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，U251細胞的生存率＊P＜0.05為轉染組與空白組比較 ＃P＜0.05為轉染組與陰性對照組比較（重復測量設計資料的方差分析）

圖4 轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，U87細胞的生存率＊P＜0.05為轉染組與空白組比較 ＃P＜0.05為轉染組與陰性對照組比較（重復測量設計資料的方差分析）

圖5 轉染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，細胞的細胞周期情況A.U251細胞；B.U87細胞

圖6 轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，細胞的凋亡情況A.U251細胞；B.U87細胞

3 討 論

腫瘤的發生是細胞增殖、凋亡和分化失衡的結果。越來越多的研究證實許多miRNA具有促進細胞增殖和存活的作用，同時還有許多miRNA具有抑制細胞增殖和存活的作用，這兩類miRNA作為癌基因和抑癌基因在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的作用［4-5］。說明將miRNA作為腫瘤治療的靶標是可行的。在近期的研究中，miR-34異常表達抑制細胞分化、克隆形成，使細胞周期阻滯在G1期［6-7］。并且，miR-34a的再表達誘導了細胞的凋亡［8］。miR-34介導的細胞凋亡能夠被p53基因的失活所抑制。miR-34a靶向一些mRNA，如SIRT1（Sirtuin type 1）、Bcl-2（B-cell lymphoma-2）、N-myc、細胞周期蛋白D1（cyclin D1），抑制這些基因轉錄［6，9-10］。最近有報道，miR-34c能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖［11］。

惡性膠質瘤是神經系統常見的腫瘤。miR-34c在人類惡性膠質瘤組織和多種細胞系中低表達。本研究利用多種細胞生物學方法，進一步探討miR-34c對膠質瘤U87和U251細胞系的生物學功能，以便為膠質瘤的治療尋找新的靶標。本研究首先檢測轉基因細胞對膠質瘤細胞增殖的影響，利用經典的CCK-8實驗對細胞進行檢測，結果顯示轉染了miR-34c-3p或miR-34c-5p的細胞能夠明顯減弱細胞的增殖，但U87細胞中miR-34c-5p與其陰性對照組比較差異無統計學意義，也就是說miR-34c-5p的抑制增殖作用比較弱，猜測在U87細胞中miR-34c-5p對細胞的抑制機制可能與miR-34c-3p有所不同。細胞周期是指一個母細胞分裂形成的細胞到下一次再分裂形成2個子細胞的時期，分為間期（G1、S、G2期）和有絲分裂期（M 期）。本研究采用流式細胞儀分析轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p后細胞周期的變化，發現轉染后的U251細胞多停滯在S期及G2／M期，而僅轉染了miR-34c-3p的U87細胞多停滯在S期，轉染了miR-34c-5p的U87細胞周期變化與空白組和陰性對照組差異無統計學意義，表明miR-34c-5p抑制U87細胞的機制與miR-34c-3p不同，這也進一步佐證了細胞增殖能力的結果。凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料，如PI有抗染性，細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。本研究結果顯示，轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p的U251細胞的凋亡率明顯增高，而轉染miR-34c-3p或miR-34c-5p的U87細胞凋亡率變化不大。

從體外實驗數據看出，miR-34c-3p和miR-34c-5p能夠抑制膠質瘤細胞增殖，導致細胞周期停滯在S期及G2／M期，誘導膠質瘤細胞的凋亡，大膽推測miR-34c-3p和miR-34c-5p在膠質瘤中扮演抑癌的角色，但miR-34c-3p與miR-34c-5p在不同細胞系中，影響細胞增殖能力、細胞周期變化及誘導細胞凋亡的效果有所不同，推測它們可能是通過不同靶點或機制起作用，有待于在以后的實驗中繼續探討miR-34c-3p和miR-34c-5p在膠質瘤的作用機制。

［1］ Nelson KM，Weiss GJ.MicroRNAs and cancer：past，present，and potential future［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（12）：3655-3660.

［2］ Gao H，Zhao H，Xiang W.Expression level of human miR-34a correlates with glioma grade and prognosis［J］.J Neurooncol，2013，113（2）：221-228.

［3］ Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer［J］.Nat Rev Genet，2009，10（10）：704-714.

［4］ Deng S，Calin GA，Croce CM，et al.Mechanisms of microRNA deregulation in human cancer［J］.Cell Cycle，2008，7（17）：2643-2646.

［5］ Medina PP，Slack FJ.microRNAs and cancer：an overview［J］.Cell Cycle，2008，7（16）：2485-2492.

［6］ Bommer GT，Gerin I，Feng Y，et al.p53-mediated activation of miRNA34candidate tumor-suppressor genes［J］.Curr Biol，2007，17（15）：1298-1307.

［7］ Tarasov V，Jung P，Verdoodt B，et al.Differential regulation of microRNAs by p53revealed by massively parallel sequencing：miR-34ais a p53target that induces apoptosis and G1-arrest［J］.Cell Cycle，2007，6（13）：1586-1593.

［8］ Hermeking H.The miR-34family in cancer and apoptosis［J］.Cell Death Differ，2010，17（2）：193-199.

［9］ Yamakuchi M，Ferlito M，Lowenstein CJ.miR-34arepression of SIRT1regulates apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（36）：13421-13426.

［10］ Christoffersen NR，Shalgi R，Frankel LB，et al.p53-independent upregulation of miR-34aduring oncogene-induced senescence represses MYC［J］.Cell Death Differ，2010，17（2）：236-245.

［11］ Choe N，Kwon JS，Kim YS，et al.The microRNA miR-34c inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia by targeting stem cell factor［J］.Cell Signal，2015，27（6）：1056-1065.