α硫辛酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠軸索損傷的保護(hù)作用

周 毅，朱一飛，李世平，王 穎，檀紅玲，檀國(guó)軍

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊050000）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘為主要病理變化的疾病［1］。既往研究認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性脫髓鞘病變是導(dǎo)致MS患者出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的主要因素［2］。近年來研究證實(shí)，除炎性脫髓鞘病變外，MS發(fā)病過程中往往還合并軸索損傷，且軸索損傷程度與MS病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)［3］。因此，研究 MS軸索損傷機(jī)制及其相關(guān)軸索損傷保護(hù)作用正成為近年的研究熱點(diǎn)。α硫辛酸作為強(qiáng)抗氧化劑，可有效抑制機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除活性氧自由基，其對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變患者周圍神經(jīng)的保護(hù)功能已得到公認(rèn)［4-5］。但α硫辛酸對(duì)MS軸索損傷的保護(hù)作用尚未明確。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型可有效演繹MS的發(fā)病過程，是臨床研究MS最常用的動(dòng)物模型。本研究以EAE模型大鼠作為研究對(duì)象，分別采用α硫辛酸和地塞米松進(jìn)行藥物干預(yù)，觀察藥物干預(yù)對(duì)EAE大鼠發(fā)病情況和軸索組織病理改變的影響，探討α硫辛酸對(duì)MS軸索損傷的保護(hù)作用，旨在為臨床MS治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 豚鼠10只，雄性，體質(zhì)量350～400 g。Wistar大鼠36只，雌性，體質(zhì)量180～200g，6～8周齡。以上動(dòng)物均購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)試劑及設(shè)備 α硫辛酸、地塞米松、完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司）；高速低溫離心機(jī)（日本三洋SCR20B型）。

1.3 動(dòng)物模型建立 取上述豚鼠10只，采用10%水合氯醛（0.5mL／100g）進(jìn)行靜脈麻醉，斷頸處死，于低溫環(huán)境下取出豚鼠脊髓并去除脊髓膜和馬尾，稱質(zhì)量并加入等質(zhì)量的4℃生理鹽水，采用勻漿機(jī)制備全脊髓勻漿（guinea pig spinal cord homogenate，GPSCH），之后加入等體積完全弗氏佐劑，二者充分混合后制成油包水型抗原乳劑，4℃保存?zhèn)溆谩ＪＳ?6只Wistar大鼠，取四肢足墊及背部皮下5點(diǎn)為注射部位，分別給大鼠注射上述油包水型抗原乳劑（0.5mL／只），并以此建立EAE動(dòng)物模型。

1.4 動(dòng)物干預(yù)及分組 待EAE大鼠第1次發(fā)病后將EAE大鼠隨機(jī)分為3組，即EAE組、LA組和DXM組，每組12只。各組自第1天發(fā)病起分別給予不同藥物進(jìn)行腹腔注射，LA組給予α硫辛酸（100mg·kg-1·d-1），DXM 組給予地塞米松（2 mg·kg-1·d-1），EAE組給予等體積生理鹽水，連續(xù)注射7d。

1.5 神經(jīng)功能檢測(cè)［6］神經(jīng)功能評(píng)價(jià)參照Kono［7］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：僅尾部無力，其余部位正常記1分；尾部、雙前肢和（或）雙后肢無力記為2分；尾部無力，雙前肢或雙后肢癱瘓，但被動(dòng)翻身后仍可復(fù)原記為3分；尾部無力，雙前肢及雙后肢癱瘓，被動(dòng)翻身后無法復(fù)原記為4分；瀕死狀態(tài)或死亡記為5分。

1.6 組織病理學(xué) 受試大鼠處死，快速取脊髓腰膨大組織并固定于40g／L多聚甲醛中。PBS緩沖液沖洗標(biāo)本，常規(guī)梯度乙醇溶液進(jìn)行標(biāo)本脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋。采用改良三色染色法進(jìn)行組織切片染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠第1次發(fā)病情況 GPSCH誘導(dǎo)免疫后，大鼠陸續(xù)出現(xiàn)精神不振、食欲下降、皮毛雜亂等癥狀；第12天大鼠第1次發(fā)病，主要表現(xiàn)為尾部無力、雙前肢和（或）雙后肢肌張力下降甚至癱瘓、斜頸、無法抬頭等；第14天大鼠進(jìn)入發(fā)病高峰期，臨床癥狀加重，主要表現(xiàn)為四肢麻痹無力（雙后肢更甚），多合并大小便失禁和精神癥狀（易激惹、攻擊行為）。

2.2 復(fù)發(fā)率 LA組和DXM組復(fù)發(fā)率均明顯小于EAE組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LA組與DXM組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組大鼠復(fù)發(fā)率比較Table 1 Recurrence rate in different groups（n＝12，只數(shù)，%）

2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 發(fā)病后7d、14d，LA組和DXM組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯低于EAE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DXM組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于LA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較Table 2 Neurologic function score in different groups（n＝12，±s，分）

表2 3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較Table 2 Neurologic function score in different groups（n＝12，±s，分）

＊P＜0.05與EAE組比較 ＃P＜0.05與LA組比較（q檢驗(yàn)）

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2.4 組織病理學(xué) 改良Bielschowsky銀染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組軸索粗細(xì)均勻、走行方向一致、軸索的連續(xù)性完好；EAE組出現(xiàn)不同程度軸索改變，可見軸突腫脹、增粗、彎曲，著色不均，呈鋸齒狀或串珠狀，不連續(xù)，甚至斷裂，髓鞘結(jié)構(gòu)層次紊亂（圖1A）；LA組軸索改變較EAE組明顯減輕，但仍有少部分軸索腫脹、粗細(xì)不均、排列紊亂（圖1B）；DXM組軸索改變情況與LA組類似（圖1C）。

圖1 各組大鼠脊髓軸索組織病理切片（改良Bielschowsky銀染色×400）A.EAE組；B.LA組；C.DXM組Figure 1 Expression of spinal cord axon in different groups（improving Bielschowsky staining×400）

3 討 論

越來越多的證據(jù)支持軸索損傷在MS的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［6，8］。氫質(zhì)子磁共振波譜檢查顯示，即使在損傷不明顯的MS患者腦區(qū)也出現(xiàn)N-乙酰天門冬氨（N-acetyl aspartate，NAA）／肌酸（creatine，Cr）比值下降現(xiàn)象，而 NAA／Cr比值變化與軸索損傷程度密切相關(guān)，提示MS早期即存在軸索損傷現(xiàn)象［9］。

本研究成功建立EAE大鼠模型，觀察結(jié)果顯示，模型大鼠至免疫誘導(dǎo)后第14天（發(fā)病期），陸續(xù)出現(xiàn)四肢麻痹無力、大小便失禁和精神表現(xiàn)異常等癥狀；首次發(fā)病之后第7天（緩解期）病情相繼緩解；首次發(fā)病后第14天大部分（復(fù)發(fā)期）大鼠再次出現(xiàn)肢體癱瘓癥狀，且此期癥狀表現(xiàn)比首次發(fā)病時(shí)更為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為極度消瘦（體質(zhì)量下降20%～30%）、背部潰瘍、口鼻出血等。改良的三色染色法結(jié)果顯示EAE模型大鼠存在明顯軸索損傷現(xiàn)象，且病程各期表現(xiàn)不一，發(fā)病期軸索損傷明顯，緩解期軸索損傷有所減輕，復(fù)發(fā)期軸索損傷加重，更甚于首次發(fā)病期。本研究結(jié)果提示，EAE模型大鼠軸索損傷趨勢(shì)與其臨床病程進(jìn)展一致，進(jìn)一步佐證了軸索損傷與MS密切相關(guān)。探討MS軸索損傷保護(hù)機(jī)制可能是臨床治療MS的新思路。

近年來研究證實(shí)，自由基是誘發(fā)MS的重要因素［10-11］。由單核細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基可介導(dǎo)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致脫髓鞘和軸突損傷；此外，自由基還可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB，上調(diào)腫瘤壞死因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1和細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)，從而促進(jìn)MS發(fā)生和發(fā)展。因此，調(diào)節(jié)機(jī)體氧自由基水平可能是治療MS的可靠途徑［12-13］。

α硫辛酸是線粒體脫氫酶的天然輔助因子，可有效清除活性氧自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化，從而減少機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。其對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變患者周圍神經(jīng)的保護(hù)功能已得到公認(rèn)。本研究顯示，采用α硫辛酸進(jìn)行干預(yù)可明顯改善EAE模型大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀；組織病理學(xué)結(jié)果證實(shí)，α硫辛酸可明顯改善EAE所致的軸索損傷現(xiàn)象；此外，采用α硫辛酸進(jìn)行干預(yù)可明顯降低EAE模型大鼠復(fù)發(fā)率。分析其原因可能與α硫辛酸對(duì)EAE所致的軸索損傷發(fā)揮保護(hù)作用有關(guān)。

綜上所述，α硫辛酸對(duì)EAE大鼠軸索損傷具有一定保護(hù)作用。然而，α硫辛酸對(duì)EAE的作用機(jī)制尚未完全明確，有待進(jìn)一步深入研究。

［1］ 紀(jì)祥，羅軍，呂建廣，等.腦部多發(fā)性硬化的CT、MRI表現(xiàn)［J］.臨床薈萃，2011，26（16）：1452-1453，封3.

［2］ 鐘曉南，胡學(xué)強(qiáng).多發(fā)性硬化的研究進(jìn)展［J］.中華神經(jīng)科雜志，2014，47（12）：886-887.

［3］ 胡學(xué)強(qiáng)，鐘曉南.多發(fā)性硬化的軸索損傷及其機(jī)制［J］.中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2012，12（2）：101-107.

［4］ Yi X，Nickeleit V，James LR，et al.alpha-lipoic acid protects diabetic apolipoprotein E-deficient mice from nephropathy［J］.J Diabetes Complications，2011，25（3）：193-201.

［5］ 張孝麗，郭暉.α硫辛酸治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（2）：281-283.

［6］ 周莉，樊永平.二黃方減少多發(fā)性硬化軸索損傷和復(fù)發(fā)的臨床研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（8）：14-15.

［7］ Kono DH，Urban JL，Horvath SJ，et al.Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL／J mice［J］.J Exp Med，1988，168（1）：213-227.

［8］ 徐雁，崔麗英.多發(fā)性硬化和視神經(jīng)脊髓炎的體液免疫機(jī)制及其干預(yù)策略［J］.生命科學(xué)，2014，26（6）：657-664.

［9］ 陳璇，李詠梅，歐陽(yáng)羽，等.不同回波時(shí)間氫質(zhì)子磁共振波譜多體素技術(shù)檢出多發(fā)性硬化病灶和看似正常腦白質(zhì)區(qū)［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2011，27（1）：32-36.

［10］ 蔡盈盈，杜昌升.多發(fā)性硬化疾病及模型小鼠中疾病相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展［J］.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（8）：826-836.

［11］ 蔣云，童興劍，王萌，等.尿酸與多發(fā)性硬化發(fā)生和復(fù)發(fā)的關(guān)系［J］.中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2013，20（2）：97-100.

［12］ 張菲菲，李靜.多發(fā)性硬化癥治療藥物研究進(jìn)展［J］.國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2014，41（3）：296-300，341.

［13］ 孟健，劉春云，張文燕，等.硫辛酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠細(xì)胞間粘附分子-1和腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2008，15（6）：682-685.