OK—432腫瘤疫苗對小鼠肝癌細胞Hca—F抑制作用的研究

喬莎++趙彬

[摘要] 目的 研究探討OK-432腫瘤疫苗對小鼠淋巴高轉移肝癌細胞Hca-F的抑制作用。 方法 對DBA/2小鼠背部接種高轉移肝癌細胞Hca-F，建立腫瘤轉移模型，設對照組和OK-432腫瘤疫苗組，3周后測量腫瘤大小，并繪制腫瘤生長曲線，檢測各組抑瘤率、淋巴結轉移抑制率，淋巴結石蠟切片HE染色觀察兩組淋巴細胞數。 結果 OK-432腫瘤疫苗具有明顯的抑瘤作用，抑瘤率達68.4%；淋巴結轉移抑制率為31.6%；通過比較對照組和給藥組淋巴結的HE染色，發現給藥組淋巴結內淋巴細胞明顯多于對照組。 結論 OK-432腫瘤疫苗能夠有效抑制腫瘤生長，促進機體免疫應答，抑制腫瘤的淋巴結轉移。

[關鍵詞] OK-432腫瘤疫苗；淋巴結轉移；抑瘤率

[中圖分類號] R739.86 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）01-0001-03

Research on inhibitory effect of OK-432 tumor vaccine on mice' liver cancer cells Hca-F

QIAO Sha ZHAO Bin

Department of Stomatology， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of OK-432 tumor vaccine on mice' highly lymph-metastatic liver cancer cells Hca-F. Methods Highly metastatic liver cancer cells Hca-F were planted in the back of DBA/2 mice and the tumor metastasis model was built. The control group and the OK-432 tumor vaccine group were set up， with 20 mice in each group. Three weeks later， the tumor size was measured， the tumor growth curve was drawn， the tumor inhibition rates and lymph node metastasis inhibition rates were detected， and the numbers of lymphocyte of the two groups were observed based on lymph gland paraffin section HE staining. Results OK-432 tumor vaccine had obvious tumor inhibition effects， with the tumor inhibition rate of 68.4%； The lymph node metastasis inhibition rate was 31.6%； Comparison of HE staining of the control group and the medication lymph node group showed that the number of lymphocyte in lymph node of the medication group was significantly larger than that of the control group. Conclusion OK-432 tumor vaccine can effectively inhibit tumor growth， promote body immune response and inhibit lymph node metastasis of tumor.

[Key words] OK-432 tumor vaccine； Lymph node metastasis； Tumor inhibition rate

近年來，腫瘤的發病率逐年增高且越來越年輕化，對患者的生命和健康造成嚴重的影響。目前全世界都在對腫瘤的預防和治療進行研究。隨著腫瘤藥理學、分子生物學及免疫學等相關學科的快速發展和交叉滲透，腫瘤疫苗作為腫瘤治療、放療、化療后的一種輔助治療手段越來越受到人們的關注，本研究所用腫瘤疫苗為OK-432腫瘤疫苗[1]。OK-432腫瘤疫苗是通過菌體與癌細胞的直接接觸，使腫瘤細胞變性并暴露瘤細胞“隱藏”著的某些抗原決定簇，從而達到增強腫瘤抗原性的目的。研究表明，OK-432腫瘤疫苗可以顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長及轉移[2]，并延長其生存期。本研究將背部接種了高轉移肝癌細胞Hca-F的DBA/2小鼠隨機分為兩組，分別給予腹腔注射OK-432腫瘤疫苗和生理鹽水，觀察OK-432腫瘤疫苗對腫瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性DBA/2小鼠40只，5～6周，體重16～20 g，購自北京維通利華實驗技術有限公司。在SPF條件下喂養，實驗前至少適應1周。

1.2 腫瘤細胞及培養方法

高轉移肝癌細胞Hca-F購自于上海愛丁堡生物科技有限公司。KLN-205腫瘤細胞在37℃，5%CO2恒溫箱傳代培養，每次使用的培養液按照45 mL的RPMI-1640培養液加入5 mL胎牛血清，0.5 mL的雙抗的比例配制。選取培養4代以上活力旺盛的腫瘤細胞作為靶細胞。

1.3 藥物與試劑

OK-432為溶血鏈球菌減毒株凍干制劑，由中外制藥株式會社（日本） 提供。青鏈霉素購自Solarbio公司；胰蛋白酶（含EDTA），無菌PBS，D-Hanks緩沖液；無支原體胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司出品。

1.4 荷瘤小鼠的制備、分組及給藥方法

疫苗的制備按Li X等[1]的方法制備而成。將Hca-F腫瘤細胞在37℃，5%CO2恒溫箱傳代培養，每次使用的培養液按照45 mL的RPMI-1640培養液加入5 mL胎牛血清，0.5mL的雙抗的比例配制。選取培養4代以上活力旺盛的腫瘤細胞作為靶細胞，用100 μL注射器及30#針頭接種于DBA/2小鼠的背部（2×105/50 μL）。實驗小鼠接種24 h后隨機分為兩組，每組20只，作為對照組（生理鹽水）和給藥組（OK-432腫瘤疫苗），接種24 h后開始給藥，給藥方式為腹腔注射，每只100 μL（5×105個），每周1次，連續給藥3周。

1.5 腫瘤大小的測定

各組小鼠處理后每天觀察腫瘤大小，每隔5天測量腫瘤最大徑a和最小徑b， 計算腫瘤體積。腫瘤體積=a×b×b×0.52（mm3）。

1.6 抑瘤率及淋巴結轉移抑制率[3]

給藥3周后處死小鼠，摘取腋下、腹部、胭窩處的淋巴結，根據淋巴結石蠟切片HE染色，計數淋巴結轉移數， 剝離原發腫瘤，測定淋巴結重量，計算抑瘤率、淋巴結轉移率及轉移抑制率。

抑瘤率=（對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/對照平均瘤重×100%；淋巴結轉移率=同組轉移小鼠數/同組小鼠數×100%；淋巴結轉移抑制率=（對照組淋巴結轉移率-給藥組淋巴結轉移率）/對照組淋巴結轉移率×100%。

1.7 淋巴結HE染色

用40 g/L甲醛固定液固定淋巴結，常規方法石蠟包埋固定，制成4 μm的石蠟切片，進行HE染色，觀察兩組淋巴細胞浸潤情況。

1.8統計學方法

應用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用方差分析，計數資料用相對數表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OK-432疫苗對DBA/2小鼠腫瘤增殖的抑制作用

腹腔注射OK-432疫苗及生理鹽水后，每隔5天測量一次腫瘤的大小，計算腫瘤體積。見表1，應用SPSS17.0軟件進行方差分析：5、10、15、20 d給藥組與對照組差異均有統計學意義（P<0.01），OK-432腫瘤疫苗可以抑制腫瘤生長。以天數為橫坐標，腫瘤的平均體積為縱坐標繪制腫瘤生長曲線，見圖1。由圖1可見對照組腫瘤生長速度明顯高于給藥組。

表1 兩組腫瘤大小比較（x±s，mm3）

圖1 腫瘤生長曲線

2.2 兩組抑瘤率及淋巴結轉移抑制率比較

給藥3周后處死小鼠，摘取腋下、腹部、胭窩處的淋巴結（包括轉移瘤），計數淋巴結轉移數，測定原發腫瘤重量，計算抑瘤率、淋巴結轉移率及轉移抑制率見表2。疫苗組原發淋巴結重量明顯低于對照組（P<0.01），抑瘤率為68.4%；淋巴結轉移率疫苗組（65%）低于對照組（95%），有統計學差異（P<0.05），淋巴結轉移抑制率為31.6%。OK-432腫瘤疫苗可以抑制腫瘤生長及腫瘤的淋巴結轉移。

表2 兩組淋巴結轉移情況比較

2.3 小鼠轉移淋巴結HE染色結果

從圖2可見，對照組淋巴結內淋巴細胞明顯少于給藥組。OK-432疫苗可以促進機體免疫應答并可抑制腫瘤淋巴結轉移。

圖2 對照組（左）與給藥組（右）小鼠淋巴結HE染色病理切片

3 討論

腫瘤疫苗是用腫瘤細胞、腫瘤抗原或腫瘤細胞裂解物等激活機體免疫系統來產生抗腫瘤效應。它是一種新型的、主動免疫治療腫瘤的方法[4]。OK-432[5-7]制劑是將A群溶血性鏈球菌（Su株）以苯基尼西林加熱處理并冷凍干燥之制劑，具有免疫活性作用。OK-432腫瘤疫苗[8，9]是把OK-432與KLN-205癌細胞通過戊二醛（GA）架橋劑交聯，剔除未結合的剩余物而制成。

本實驗通過給接種了肝癌腫瘤細胞的小鼠腹腔注射腫瘤疫苗，觀察腫瘤疫苗對小鼠腫瘤的抑制作用，結果顯示，OK-432腫瘤疫苗可以抑制腫瘤細胞生長，抑制腫瘤細胞的淋巴結轉移，能夠激活機體免疫，增強小鼠抗腫瘤能力。其抗腫瘤機制可能為：①OK-432腫瘤疫苗使菌體與癌細胞直接接觸，利用OK-432直接殺傷癌細胞的作用使腫瘤細胞變性，能使細胞膜和細胞內的腫瘤抗原得到加工呈遞與外露，從而腫瘤細胞“隱藏”著的某些抗原決定簇被暴露，使腫瘤抗原性增強得到增加[10，11]。②OK-432腫瘤疫苗可以激活宿主CD4+Th1細胞主導的細胞免疫，增強巨噬細胞和NK細胞的抗腫瘤作用，從而誘發CTL應答，使荷瘤小鼠腫瘤的生長得到顯著抑制，延長小鼠生命，激發和增強宿主的特異性免疫功能[12]。

綜上所述，OK-432腫瘤疫苗不僅可以抑制腫瘤的生長，而且可以增強機體免疫應答，并可抑制腫瘤的轉移，值得臨床上推廣應用。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-07-29）