羊流產(chǎn)衣原體的分離鑒定及間接免疫熒光法檢測

趙榮，李兆才，曹小安，周繼章

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046)

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羊流產(chǎn)衣原體的分離鑒定及間接免疫熒光法檢測

趙榮，李兆才，曹小安，周繼章*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046)

對收集的疑似衣原體感染的羊流產(chǎn)胎兒樣本接種雞胚卵黃囊進行分離培養(yǎng)，通過PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性分析)方法鑒定為流產(chǎn)衣原體。將收集到的流產(chǎn)衣原體陽性樣本接種Hela229細胞，應(yīng)用基于流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體的間接免疫熒光法，在Hela229細胞漿內(nèi)可見呈綠色熒光的衣原體包涵體，進一步在病原學(xué)水平上確定發(fā)生在甘肅省肅南縣羊流產(chǎn)的病原為流產(chǎn)衣原體。

流產(chǎn)衣原體；分離鑒定；PCR-RFLP；間接免疫熒光法

流產(chǎn)衣原體(Chlamydiaabortus)是羊地方性流產(chǎn)的病原[1]，也能引起豬、牛等多種動物在妊娠晚期發(fā)生流產(chǎn)[2]。主要寄生于牛、羊、豬等多種動物生殖道黏膜表面的上皮細胞，造成生殖道黏膜受損，引發(fā)母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎等，偶爾會感染妊娠婦女，引起急性感染或流產(chǎn)[3]。在我國，自20世紀80年代以來，豬、羊等動物衣原體病[4]在寧夏[5]、青海[6]、陜西[7]等多個省、市、自治區(qū)均有發(fā)病和大面積流行的報道[8-9]。有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，部分地區(qū)牧場的衣原體陽性率高達80%，該疫病的發(fā)病情況呈逐年上升的趨勢，已經(jīng)造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影響我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展[10]。

2014年，甘肅省肅南縣某羊場部分懷孕羊突然在妊娠晚期發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱胎現(xiàn)象嚴重，給羊場造成了嚴重的經(jīng)濟損失。根據(jù)臨床癥狀，初步懷疑為羊衣原體病。為盡快控制疾病的流行，對病原進行了分離鑒定。目前，最常用的動物衣原體檢測方法是間接血凝方法(IHA)。該法操作簡便，省時快捷，適用于血清學(xué)調(diào)查，但無法區(qū)分衣原體屬下面的不同種，而且判定結(jié)果是用肉眼進行觀察，容易出現(xiàn)誤判。為此，本研究通過病原的分離培養(yǎng)、間接免疫熒光染色等病原學(xué)方法進行了確診檢測。

1 材料與方法

1.1 材料 4份病料為采集自甘肅省肅南縣的疑似衣原體感染的4只羊流產(chǎn)胎兒肝臟和脾臟；流產(chǎn)衣原體標準株SX5、鸚鵡熱衣原體CpL和反芻動物衣原體E58為本實驗室分離保存菌株；SPF雞胚購自蘭州市榆中縣種雞場；Hela229細胞購自ATCC，由本實驗室傳代后于液氮中保存；DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Biological Industries (BI)公司；胰蛋白酶-EDTA溶液購自Solarbio公司；放線菌酮購自Sigma公司，用PBS溶液配制成濃度為1 mg/mL的儲存液，0.22 μm細菌濾器過濾分裝保存；DEAE-dextran購自Sigma公司，用PBS溶液配制成濃度為30 mg/mL的儲存液，0.22 μm細菌濾器過濾分裝保存；鼠抗流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；FITC標記的羊抗鼠IgG抗體購自KPL公司；Giemsa染液購自Solarbio公司；洗滌緩沖液是含0.1% Triton x-100和1 mg/mL BSA的PBS溶液。

1.2 方法

1.2.1 羊流產(chǎn)衣原體的分離 將采集的羊流產(chǎn)胎兒的肝臟和脾臟等研碎后，用適量含卡那霉素(50 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的生理鹽水稀釋，4 ℃放置4 h，再以2000 r/min離心30 min，取上清，接種于7日齡雞胚卵黃囊中。棄去接種后3 d內(nèi)死亡的雞胚，收集4～9 d死亡雞胚的卵黃囊膜，連續(xù)傳代。若初次接種分離時，未致死雞胚再盲傳3～4代直至雞胚有規(guī)律死亡。提取收集的卵黃囊膜所有DNA，進行PCR檢測，陽性培養(yǎng)物于-80 ℃保存，進行進一步鑒定。

1.2.2 PCR檢測 為鑒定樣本是否為衣原體感染，以收集的4～9 d死亡雞胚的卵黃囊膜基因組為模板，根據(jù)GenBank公布的流產(chǎn)衣原體helicase gene clone 8的核苷酸序列，設(shè)計針對流產(chǎn)衣原體helicase gene clone 8的引物，以樣本基因組為模板，進行PCR擴增。上游引物：5’-TGGTATTCTTGCCGAC-3’；下游引物：5’-GATCGTAACTGCTTAATAAACCG-3’。PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物用含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察目的片段的大小[11-12]。同時將流產(chǎn)衣原體標準株SX5、鸚鵡熱衣原體CpL和反芻動物衣原體E58，一起進行PCR擴增。

1.2.3 限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP) 將helicase gene clone 8 基因的PCR擴增片段用限制性內(nèi)切酶Alu I消化，20 μL消化液中含PCR產(chǎn)物10 μL、滅菌去離子水7 μL、10×buffer 2 μL、AluI 1 μL，混勻后置37 ℃過夜，65 ℃或80 ℃ 20 min將酶滅活，消化產(chǎn)物用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測[11-12]。

1.2.4 流產(chǎn)衣原體的細胞培養(yǎng) 常規(guī)方法于96孔板中培養(yǎng)Hela229細胞，待長成單層后，以含30 μg/mL DEAE-dextran的DMEM培養(yǎng)液預(yù)處理10 min，接種適量衣原體陽性的雞胚卵黃囊膜懸液，每孔100 μL，3000 r/min離心60 min，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)放置2 h，棄掉接種液，每孔加入200 μL含10% FBS和0.5 μg/mL放線菌酮的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 流產(chǎn)衣原體包涵體的Giemsa染色檢測 樣本接種細胞48～72 h進行Giemsa染色檢測衣原體包涵體，具體操作步驟如下：吸出細胞培養(yǎng)孔內(nèi)的衣原體生長培養(yǎng)液，用無水甲醇固定單層細胞10 min，空氣中充分揮發(fā)，加Giemsa染液染色30 min，用95%乙醇快速洗滌1次或PBS洗滌3次，干后鏡檢。

1.2.6 流產(chǎn)衣原體包涵體的間接免疫熒光法檢測細胞于接種48～72 h后，吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷PBS洗滌2次，-20 ℃無水甲醇固定單層細胞10 min[13]，預(yù)冷洗滌緩沖液(Washing Buffer, WB)振蕩洗滌3次，每次3 min；加入鼠抗流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體100 μL(用10% FBS 50倍稀釋)，4 ℃過夜孵育，預(yù)冷WB振蕩洗滌3次，每次3 min；加入FITC標記的羊抗鼠IgG抗體100 μL(用10% FBS 100倍稀釋)，37 ℃避光孵育45 min，用預(yù)冷WB振蕩洗滌5次，每次3 min；DAPI染色5～10 min，然后用預(yù)冷PBS振蕩洗滌3次，每次3 min；最后在熒光顯微鏡下觀察，并拍照。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果 依據(jù)設(shè)計的引物，對4份樣本進行了擴增，其中3份均獲得約479 bp的單一目的片段，一份為陰性，與預(yù)期標準值相符，PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

1,9: DNA Ladder 100; 2:C.abortus SX5; 3:C.psittaci CPL; 4:C.pecorum E58; 5,6,8:陽性樣本；7:陰性樣本圖1 helicase gene clone 8基因的PCR結(jié)果

2.2 RFLP結(jié)果 通過對helicase gene clone 8 基因的PCR擴增片段用限制性內(nèi)切酶AluI消化，得到了如圖2所示的結(jié)果。

2.3 Giemsa染色檢測結(jié)果 普通光學(xué)顯微鏡下觀察，在感染的Hela229細胞胞漿中可見橢圓形或帽狀的衣原體包涵體，胞漿淡染，包涵體呈藍紫色(圖3箭頭所示)。

2.4 間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)檢測結(jié)果 將接種流產(chǎn)衣原體分離株48～72 h的Hela229細胞固定后，以抗流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體進行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察，在感染的Hela229細胞內(nèi)可見藍色的細胞核旁呈綠色橢圓形或帽狀的流產(chǎn)衣原體包涵體(圖4)。

3 討論與小結(jié)

本研究通過設(shè)計衣原體種特異性引物helicase gene clone 8的引物，對樣本基因組進行了PCR擴增。雖然反芻動物衣原體也可引起羊流產(chǎn)，但是PCR未能擴增出E58菌株helicase gene clone 8基因，說明造成甘肅肅南縣羊的衣原體性流產(chǎn)不是由反芻動物衣原體引起的。對于流產(chǎn)衣原體和鸚鵡熱衣原體的區(qū)分早有報道[12,14]，本研究對helicase gene clone 8基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)AluI消化后進一步RFLP分析，鸚鵡熱衣原體CpL helicase gene clone 8片段未被切開，仍為479 bp，而陽性樣本的helicase gene clone 8基因則被切為兩個片段，這與流產(chǎn)衣原體標準株SX5的特征一致，說明本次羊流產(chǎn)是由流產(chǎn)衣原體導(dǎo)致的。

為了從病原學(xué)上進一步的鑒定，本研究在Hela229細胞上對分離到的衣原體進行了培養(yǎng)。分別采用Giemsa染色法和基于流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體的間接免疫熒光法對流產(chǎn)衣原體包涵體進行檢測，從Giemsa染色情況來看，可以觀察到有衣原體的包涵體形成，但無法確定為流產(chǎn)衣原體。通過進一步的間接免疫熒光觀察，Hela229細胞內(nèi)可見藍色的細胞核旁呈綠色橢圓形或帽狀的衣原體包涵體，這從病原學(xué)上再次證明，本次羊流產(chǎn)是由流產(chǎn)衣原體引起的。間接免疫熒光法在人沙眼衣原體的分離鑒定上，素有“金標準”之稱，但是對于動物衣原體病原學(xué)診斷方面除PCR之外，在細胞培養(yǎng)上還未建立起好的診斷方法，因此，本研究所建立的間接免疫熒光診斷技術(shù)不僅為將來建立動物衣原體細胞感染診斷奠定基礎(chǔ)，也為將來通過細胞培養(yǎng)獲得流產(chǎn)衣原體感染滴度、制備動物衣原體滅活疫苗奠定前期的科學(xué)基礎(chǔ)。

總之，本研究通過對肅南縣羊流產(chǎn)物雞胚分離，通過PCR-RFLP鑒定、Giemsa染色以及間接免疫熒光檢測，確定該地區(qū)的羊流產(chǎn)為流產(chǎn)衣原體所導(dǎo)致，這為藥物治療及疫苗防控提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] Thomson N R, Yeats C, Bell K,etal.TheChlamydophilaabortusgenome sequence reveals an array of variable proteins that contribute to interspecies variation[]J.Genome Research, 2005, 15(5):629-640.

[2] 閆少俠.豬流產(chǎn)嗜性衣原體單抗制備及阻斷ELISA檢測方法的建立[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[3] 吳移謀.衣原體[M].1版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：60, 201.

[4] 韓宏軍.豬衣原體病的診治[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2014，30(8):148.

[5] 陳廷和，王守智，李景水，等.寧夏羊衣原體病的血清學(xué)診斷及預(yù)防試驗[J].寧夏農(nóng)林科技，1994，6: 30-32.

[6] 謝昌元，王光華，李明錄，等.青海省羊衣原體病綜合防制措施[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2013，43(3): 39-40.

[7] 林治涌，梁督軍，張志珍，等.陜西省羊衣原體病的診治[J].中國獸醫(yī)雜志 ，1994，20(6)：24-25.

[8] 羅意，周碧君，張華，等.貴州省7個地區(qū)主要山羊流產(chǎn)疫病的流行病學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45(6)：62-65.

[9] 李云龍.云南省楚雄州豬衣原體病血清流行病學(xué)調(diào)查報告[J].當代畜牧，2014，11:29-30.

[10]梅仕林.豬流產(chǎn)嗜性衣原體病間接ELISA抗體檢測方法的建立[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[11]Kalender H, Kilic A, Eroksuz H,etal.Identification ofChlamydophilaabortusinfection in aborting ewes and goats in Eastern Turkey[J].Rev Med Vet, 2013, 164(6):295-301.

[12]Crealan J, Mc Cullough L.Evaluation of strain specifc primer sequnces from an abortifacient strain of ovineChlamydophilaabortus(Chlamydiapsittaci) for the detection of EAE by PCR[J].FEMS Microbiol Lett, 2000, 190: 103-108.

[13]Borel N, Dumrese C,Ziegler U,etal.Mixed infections withClamydiaand porcine epidemic diarrhea virus - a newinvitromodel of chlamydial persistence[J].BMC Microbiology, 2010, 10: 201-209.

[14]Ongor H, Cetinkaya B, Acik M N,etal.Detection ofChlamydophilaabortusin ovine milk by immunomagnetic separation-polymerase chain reaction[J].J Vet Med, 2004, 50: 43-45.

(編輯：李文平)

Isolation and Identification of OvineChlamydiaabortusand Detection with Indirect Immunofluorescence

ZHAO Rong, LI Zhao-cai, CAO Xiao-an, ZHOU Ji-zhang*

(StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResarchInstitute,ChineseAcedemyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China)

The sample was collected from the suspectedChlamydiaabortus(C.abortus) infected fetal, which was inoculated into the SPF embryonated chicken eggs.It was identified asC.abortusby PCR-RFLP method.The sample which was PCR-RFLP positive was inoculated on Hela229 cell and then the whole cell inclusions ofC.abortuswere detected by indirect immunofluorescence assay (IIF) based on anti-C.abortusMOMP monoclonal antibody.Chlamydial inclusion of green fluorescence could be seen in the cytoplasm of Hela229 cells by IIF.It indicated on etiology level that the abortion in sheep in Sunan country was caused byChlamydiaabortus.

Chlamydiaabortus; isolation and identification; PCR-RFLP; indirect immunofluorescence

趙榮，碩士研究生，從事動物疫苗與分子免疫研究。

周繼章。E-mail:zhoujizhang@126.com

2015-08-25

A

1002-1280 (2015) 11-0021-04

S852.67