雞傳染性支氣管炎病毒AH1/15株S1基因的克隆與序列分析

于雷，張賀楠，張釗偉，程海波，史張燕，周建民

(1.中牧實業股份有限公司農業部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京 100095；2.乾元浩生物股份有限公司，北京 100083)

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雞傳染性支氣管炎病毒AH1/15株S1基因的克隆與序列分析

于雷1，張賀楠1，張釗偉1，程海波2，史張燕2，周建民1

(1.中牧實業股份有限公司農業部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室，北京 100095；2.乾元浩生物股份有限公司，北京 100083)

2015年1月從安徽省某疑似患雞傳染性支氣管炎雞場中分離到一株雞傳染性支氣管炎病毒，命名為AH1/15株，使用特異性引物對AH1/15分離株S1基因進行擴增、克隆及序列測定，并將其與國內外流行株及參考毒株進行比對。結果顯示，IBV AH1/15株S1基因全長為1638 bp；同源性分析結果發現，AH1/15株與國內外疫苗毒株核苷酸同源性為57.0%～59.6%；遺傳進化分析結果發現，AH1/15株與國內外主要疫苗株以及流行的LX4型毒株親緣關系較遠，與近幾年國內分離的CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/SD09/005等毒株親緣關系最近。結果表明，AH1/15是一株不同于疫苗株和流行株的變異株。

傳染性支氣管炎病毒；S1基因；序列分析

雞傳染性支氣管炎(avian infectious bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病[1]，給養禽業帶來巨大經濟損失。目前主要采用疫苗接種的方法來預防該病，Mass型疫苗在國內得到了廣泛應用，但由于IBV基因組易突變及頻繁重組的特點，在傳播過程中導致多種基因型及血清型毒株的產生[2]，加之不同血清型之間交叉免疫性很低[3]，這就導致免疫雞群依然會受IBV野毒的威脅，給我國IB疫情防控帶來了極大的困難。由于IBV的S1蛋白在致病性、組織嗜性及宿主細胞的識別和結合方面都有重要作用[4]，同時是中和抗體的主要誘導者[5]，且S1基因型劃分與血清學分型具有良好的對應關系[3]，所以常用此基因的遺傳進化關系、序列分析來研究IBV的流行趨勢。AH1/15株分離自安徽某發病雞場，本試驗對其S1基因進行測序及遺傳進化分析，以了解其分子流行病學特征，為該病的防控奠定基礎。

1 材料與方法1.1 毒株 IBV AH1/15株來自安徽某發病商品雞群，由中牧實業股份有限公司研究院分離和保存。

1.2 菌種和載體E.coli感受態細胞DH5α、克隆載體pEASY-T1購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 主要試劑與酶類 Ex Taq酶、DNA Marker、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA Maker Trans2K Plus均購自北京全式金生物技術有限公司，其他化學試劑均為國產分析純。

1.4 引物設計與合成 根據IBVS1基因兩端外的保守序列設計擴增S1全基因的引物，上游引物：GTGTATTTTGACGTTGCTAAG；下游引物：AGCAAAGGTGCCACAAAATG，預期擴增片段大小為1868 bp。引物由北京三博遠志公司合成。

1.5 IBVRNA的提取 按照RNA提取試劑盒的使用說明書操作，從雞傳染性支氣管炎病毒AH1/15株的雞胚尿囊液中提取病毒RNA。

1.6 IBVAH1/15株S1基因的擴增、克隆和測序 以提取的病毒RNA為模板，通過隨機引物進行反轉錄獲得cDNA，以合成的cDNA為模板，通過上、下游引物，經PCR擴增S1基因，反應條件為：95 ℃預變性5 min，然后按以下參數(變性：94 ℃ 30 s；退火：53 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 1 min 45 s)進行31個循環，循環結束后72 ℃延伸10 min。將PCR產物與pEASY-T1載體進行連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。挑選陽性克隆送北京三博遠志公司測序。

1.7 S1基因的序列分析 應用DNAStarLasergene 7.0軟件對AH1/15株的S1基因測序結果進行拼接，利用MEGALIGN程序的Clustal W方法對分離株和參考毒株的S1基因核苷酸序列進行對比和分析。采用MEGA 4.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)方法進行遺傳演化分析，并繪制系統進化樹。分析中涉及的IBV參考毒株及其S1基因GenBank登錄號見表1。

表1 參考毒株及其GenBank登錄號

2 結果與分析

2.1 IBV S1基因的擴增 RT-PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，可見特異條帶，與預期片段大小相符，見圖1。

M：Trans2K Plus Marker 1：S1基因的RT-PCR產物 2：陰性對照圖1 AH1/15株S1基因的RT-PCR產物

2.2 序列比對結果 測序結果表明，IBV AH1/15株S1基因全長為1638 bp(含裂解位點)；選取具有代表性的國內外毒株及疫苗株進行S1全基因序列比對，結果顯示，IBV AH1/15株S1基因核苷酸序列與國內廣泛使用的Mass型疫苗株H120、H52的同源性為57.0%和57.1%，與LDT3型tl/CH/LDT3/03毒株同源性為59.6%，與4/91毒株同源性為59.2%，與QX株、LX4株的同源性分別為60.2%和60.3%，與LSC99I毒株同源性為53.5%，與LDL97I毒株同源性為57.3%，與國內外近些年分離的CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/SD09/005ck-CH-LHB-110615、K46/10和K23/10毒株同源性較高，為98.0%～99.3%，其中與CK/CH/GD/CG11同源性最高，為99.3%。以疫苗株H120、M41、4/91和LDT3為參考株，AH1/15、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4和CK/CH/SD09/005S1基因表現為廣泛性點突變，多處堿基插入或缺失，且大多具有相同的插入和缺失位點；AH1/15、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4毒株和同源性較高的CK/CH/SD09/005、ck/CH/LHB/110615、K46/10和K23/10相比在S1基因283～285 nt處也有3 堿基缺失。

2.3 以IBV S1全基因為基礎的遺傳進化分析 利用MEGA4.0軟件對AH1/15株和其他參考毒株遺傳進化分析并生成系統進化樹，見圖2。

圖2 AH1/15株(▲標記)S1基因與參考毒株核酸系統進化分析

分析結果表明，AH1/15株與參考毒株形成7個進化分支(基因型)。LX4、QX、A2等毒株形成LX4型分支，4/91、7/93B屬于4/91型，LNM 05I、LGD 04II等構成CK/CH/LSC/99I型，CH/CH/LDL/97I型包括LDL97I、LDL98I等，國內疫苗株H120、H52、M41和LDT3則分屬于Mass型和tl/CH/LDT3/03型。分離株AH1/15株和前6 個分支遺傳距離較遠，與2007年以來國內和韓國分離株CK/CH/GD/CG11、CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/SD09/005、K46/10等形成獨立的進化分支。

3 討論

近年來，通過S1基因分型的方法研究發現，我國同時流行多個IBV基因型的毒株，如LX4型、CK/CH/LSC/99I型、CK/CH/LDL/97I、tl/CH/LET3/03型、Mass型等，其中LX4型是目前流行最為廣泛的基因型，比例超過50%，部分地區甚至高達75%[3,6]。

當前，IB仍是困擾我國養雞業發展的重要疫病之一，臨床發病普遍，疫苗免疫預防是控制該病的最為有效的手段之一。目前國內使用疫苗的基因型多為Mass型，但是Mass型毒株只占國內分離毒株的一部分，大部分分離毒株與其遺傳距離較遠。Mass型的疫苗已經不能對當前流行的LX4型、CK/CH/LSC/99I型等毒株產生完全的免疫保護[7]，因此，研發具有針對性的疫苗顯得尤為必要。

AH1/15株與CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11等屬于獨立的進化分支，與LX4、4/91和Mass基因型毒株遺傳距離均較遠，其S1基因不僅有較多的堿基突變，而且還有多處堿基插入和缺失。這是2007年以來新出現的一個基因型，TC07-2是首次報道的此類毒株[8]，山東和韓國也先后報道了這一新型IBV流行株[9-10]，提示該類毒株在亞洲地區已經形成一定程度的流行，并且Mass型H120活疫苗不能對該基因型的毒株產生有效的保護[10]，這也就不難解釋本研究中的發病雞場即使進行過系統的傳染性支氣管炎疫苗免疫，但是仍然感染雞傳染性支氣管炎的現象。

因此，我們要對IB進行持續的流行病學監測，同時有必要針對性地選擇IB疫苗對分離野毒進行免疫效力評價或研制新型IB疫苗，為IB防控提供科學依據。

[1] Saif Y M．Disease of Poultry[M]．12th Edition．IA：Blackwell Publishing，2008：101-119．

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(編輯：李文平)

Cloning and Sequence Analysis of S1Gene of Avian Infectious Bronchitis Virus AH1/15 Strain

YU Lei, ZHANG He-nan, ZHANG Zhao-wei, CHENG Hai-bo2, SHI Zhang-yan2, ZHOU Jian-min

(1.ChinaAnimalHusbandryIndustryCo.,Ltd,KeyLaboratoryofBiologicalProductsandChemicalDrugsforAnimals,MinistryofAgriculture,Beijing100095,China; 2.QYHBiotechCompanyLimited,Beijing100083,China)

One infectious bronchitis virus (IBV) was isolated from Anhui province, named as AH1/15 isolate.S1 gene of the strain was amplified, cloned and sequenced.The S1gene of the strain was composed of 1638 base pairs, the nucleotide acid similarities among the vaccine strains and the AH1/15 strain were57.0%～59.6%.The genetic evolution analysis showed that AH1/15 strain had far relationship with the vaccine strains andLX4 type strains, but showed the closest relationship with the strains which isolated in recent years, such as CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11 and CK/CH/SD09/005.The result showed that the variant IBV AH1/15 was different from vaccine and epidemic strains.

infectious bronchitis virus；S1 gene；sequence analysis

于雷，碩士，執業獸醫師，從事獸用生物制品研發工作。E-mail：sgyulei@sohu.com

2015-08-25

A

1002-1280 (2015) 11-0017-04

S852.65