硫酸軟骨素對LLO誘導大鼠腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO、ET-1的影響

陳希，穆祥，許劍琴

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2.北京農學院動物科學技術學院，北京102206；3.中國農業大學動物醫學院，北京 100094)

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硫酸軟骨素對LLO誘導大鼠腸黏膜微血管內皮細胞分泌NO、ET-1的影響

陳希1，穆祥2*，許劍琴3*

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；2.北京農學院動物科學技術學院，北京102206；3.中國農業大學動物醫學院，北京 100094)

為研究李斯特菌溶血素(LLO)對大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(RIMVECs)分泌NO、內皮素(ET-1)的影響，以及硫酸軟骨素(CS)通過調節細胞微環境保護RIMVECs的作用，將體外培養的RIMVECs分為LLO+CS組、LLO組、CS組、空白組，經過MTT比色法測定細胞生長情況，硝酸還原酶法測定細胞上清液細胞因子NO含量以及酶聯免疫法檢測ET-1含量，并用原位雜交方法對結果進行驗證。結果表明：LLO可抑制RIMVECs增殖活性，提高NO、ET-1分泌量且高于正常水平，并導致NO/ET-1比值失衡(下降)；而CS可提高RIMVECs細胞的增殖活性，并顯著上調NO/ET-1比值。由此可知，CS可通過改善LLO引起細胞因子NO和ET-1失衡而起到保護微血管內皮細胞的作用。

硫酸軟骨素；腸黏膜微血管內皮細胞；NO；ET-1；LLO

產單核細胞李斯特菌(L.monocytogenes，LM)的致病機理是通過分泌致病因子溶血素(Listeriolysin O，LLO)作用于內皮細胞，導致細胞因子分泌紊亂，從而誘發機體產生病理癥狀[1]。硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)是由動物軟骨分離得到的一種硫酸多糖，是細胞外基質的主要成分，也是動物類中藥(骨類、角類)的重要成分之一，具有降血脂、抗凝、抗血栓形成，并有保護血管內皮免受多種化學物質損傷的作用[2]。近年來，CS作為硫酸多糖之一，具有抗凝血、調節細胞黏附、調節炎癥、調節免疫、阻礙血管生成、抗氧化等多種藥理活性[3-5]。其對體外人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用亦有報道[6]。針對文獻所報道的CS具有保護內皮細胞、調節細胞因子的作用，本研究首次以大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(Rat Intestinal Mucosal Microvascular Endothelial Cells, RIMVECs)為試驗對象，研究CS調節LLO導致的細胞微環境紊亂，以及對LLO致RIMVECs損傷的作用效果。

1 材料和方法

1.1 試劑及藥品材料 硫酸軟骨素標準品,HPLC≥98%, 批號A0318，成都曼思特生物科技有限公司；LLO,ProSpec-TanyTechnoGene公司；DMEM 培養基、優級胎牛血清,Gibco公司；NO測試試劑盒,晶美生物工程有限公司；內皮素(ET-1)酶聯免疫檢測試劑盒,RB，北京尚柏生物公司；原位雜交檢測試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司，產品編號分別為MK1059、MK1190。

1.2 儀器與設備 CO2恒溫培養箱(MCO-17AC型，日本三洋公司)；倒置數碼熒光顯微鏡(DMB5型，廈門麥克奧迪公司)；細胞培養板(6、12、48孔，costar公司)；細胞計數板(浙江玉環求精醫用儀器廠)。

1.3 試驗方法

1.3.1 大鼠腸黏膜微血管內皮細胞分離培養 選擇出生24 h之內SD大鼠，用無菌方法取出空腸，Hank’s液沖洗，縱向切開。沖洗后將組織剪成小段，吹打數次，經胰酶消化暴露出微血管網，接種于24孔細胞培養板中。加入DMEM完全培養基(含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素)，于37 ℃、5%CO2培養箱培養，3 d換液1次，細胞達到80%融合生長時即行傳代。倒置顯微鏡下，細胞呈典型的鋪路石狀相嵌排列，無重疊生長現象；免疫熒光法檢測內皮細胞vWF因子相關抗原陽性。

1.3.2 細胞準備及處理 用0.25%胰蛋白酶消化已經融合生長的第2代RIMVECs，細胞懸液接種于96孔細胞培養板，細胞密度5×108/L。每孔加150 μL DMEM完全培養基，置37 ℃、5% CO2培養箱培養，待融合成單層細胞后，將RIMVECs分為LLO+CS組(培養基中LLO濃度為50 ng/mL+CS濃度為10 μg/mL)、LLO組(LLO濃度為50 ng/mL)、CS組(CS濃度為10 μg/mL)、空白組(LLO濃度為0 ng/mL)，每組設重復孔5孔，空白對照組加維持培養液，分別于培養3、6、9、12 h后收集細胞培養液，3000 r/min離心5 min后，取上清液于-20 ℃條件待測。

1.3.3 細胞增殖活性的測定(MTT法) 根據文獻方法[7]，將96孔細胞培養板置入CO2培養箱中，37 ℃靜置培養24 h。吸凈細胞上清液后，在各孔細胞中加入5 mg/mL的MTT 30 mL及150 mL的DMEM維持培養基，繼續培養4 h后，輕輕吸棄孔內液體，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃孵育30 min 以上，使細胞內結晶充分溶解，于酶標儀570 nm波長處測定各組OD值。

1.3.4 細胞上清液中NO、ET-1濃度的測定 根據文獻方法[8]，NO濃度的測定采用硝酸還原酶法。參照試劑盒說明，以總硝酸鹽(NOx)含量表示NO 濃度。ET-1濃度的測定按照ELISA試劑盒的操作步驟進行。

1.3.5 原位雜交 根據文獻方法[8]，針對大鼠誘生型一氧化氮合酶(iNOS)靶基因的mRNA 序列為：5’-GGAAAAGGACATTAACAACAACGTGGAGAA-3’；5’-GACCAGAGGACCCAGAGACAAGCCCACCCC-3’；5’-CTTCCAGCTCAAGAGCCAGAAACGTTATCA-3’。

針對大鼠ET-1 靶基因的mRNA 序列為：5’-GTGACTTTCCAAGGAGCTCCAGAAACAGCTGTCTT-3’；5’-AAGACAAGAAGTGCTGGAATTTCTGCCAAGCAGGA-3’

采用多相寡核苷酸探針和高敏感標記技術，并配合使用敏感性加強型的原位檢測方法。將處理后12 h各組細胞滴加含有1/1000 DEPC的4%多聚甲醛固定，3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化，加地高辛標記的寡核苷酸探針雜交，封閉，滴加兔抗地高辛，滴加生物素化羊抗兔IgG， 3,3-二氨基苯聯胺(DAB) 顯色，陽性結果呈棕黃色。

2 結果與分析

2.1 CS抗LLO對RIMVECs增殖的影響 由圖1可知，LLO組與其他各組相比，細胞增殖(OD值)極顯著下降(P<0.01)。試驗結果表明，LLO對細胞起負增殖作用，即抑制細胞增殖或對細胞造成損傷，而CS有效緩解了細胞損傷。

2.2 CS對LLO誘導RIMVECs分泌NO、ET-1的影響 由表1可知，12 h內LLO組NO分泌量高于正常水平，而LLO+CS組NO分泌量高于LLO組，12 h內差異極顯著(P<0.01)；與空白組對比，CS組RIMVECs的NO的分泌量于6-9 h有所上調，12 h時測得NO值和空白組無顯著差異(P>0.05)，說明CS短期內具有上調RIMVECs分泌NO的作用。由表2可知，LLO組細胞ET-1分泌量高于空白組(P<0.01)；與LLO組相比，LLO+CS組分泌量于6h開始明顯下降(P<0.05)，說明CS對LLO誘導RIMVECs分泌ET-1的升高有顯著抑制作用。

*表示與空白組對照， **代表P<0.01，*代表P<0.05;# 表示與LLO組對照， ## 代表P<0.01圖1 CS抗LLO對RIMVECs增值的影響(12 h)

表1 各時間段細胞上清NO濃度的測定結果 mol/L

*表示與空白組對照， ** 代表P<0.01，*代表P<0.05； # 表示與LLO組對照，## 代表P<0.01，# 代表P<0.05

表2 各時間段細胞上清ET-1濃度的測定結果 pg/mL

*表示與空白組對照， ** 代表P<0.01，*代表P<0.05； # 表示與LLO組對照，## 代表P<0.01，# 代表P<0.05

2.3 CS對LLO導致RIMVECs分泌NO、ET-1平衡紊亂的影響 生理狀態下NO、ET-1是一對維持動態平衡的細胞因子,根據前面測定的各組細胞NO、ET-1分泌量，計算出NO/ET-1的比值，觀察CS對維持細胞微環境穩定的影響。如圖2所示，空白組比值維持在10左右，而CS有效緩解了LLO導致的NO/ET-1失衡。

圖2 不同時間段測得各組細胞NO/ET-1的比值

2.4 陽性細胞胞漿平均光密度值 由表3和圖3可知，處理后12 h，測定各組細胞平均光密度值與NO、ET-1 mRNA表達量測定值一致。

表3 NO、ET-1 mRNA表達陽性細胞胞漿平均光密度值(12 h)

A：空白組iNOS表達；B：LLO組iNOS表達；C：LLO+CS組iNOS表達；D：空白組ET-1 mRNA表達；E：LLO組ET-1 mRNA表達；F：LLO+CS組ET-1 mRNA表達圖3 各組iNOS、ET-1 mRNA表達結果(12 h)

3 討論與小結

血管內皮細胞受損是創傷、感染、休克、腫瘤、全身性炎癥反應綜合征以及多器官功能障礙發生、發展的病理學基礎[9-11]。腸黏膜作為機體屏障部位，必然在腸道感染、細菌移位中起到關鍵作用。而腸黏膜上的微血管內皮細胞不僅是被動的靶細胞，更是一種效應細胞，可分泌NO對動、靜脈和微血管均有擴張作用，能夠抑制缺氧引起的血管收縮，并具有抗血栓形成的作用；而ET-1是目前已知的最強大的血管收縮劑，其作用正好同NO相頡頏，兩者之間的動態平衡是調控血管壁緊張度，微血管內微血栓形成的重要因素。試驗結果表明，CS可有效上調LLO誘導的NO分泌，同時下調RIMVECs分泌的ET-1，其實質是調節NO/ET-1的比值。藥物通過調節一對互相頡頏的活性物質，使其從紊亂狀態形成新的平衡，維持機體細胞微環境穩定，有效控制疾病的發生發展。

NO的合成需要一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的參與。NOS主要有誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和原生型一氧化氮合酶(cNOS)。本試驗原位雜交中檢測的iNOS在正常條件下不存在或少量表達，毒素或其他細胞因子刺激時誘導其基因表達，經數小時即可產生大量的NO。而cNOS在正常條件下即存在，是細胞結構的一部分，調控生理狀態下NO的基礎釋放，其主要的生物效應為傳遞細胞間的信息。因此，原位雜交試驗以iNOS作為檢測標準。試驗中測定各組細胞平均光密度值與NO、ET-1 mRNA表達量測定值一致，該比對結果證實了CS具有調控LLO誘導的RIMVECs分泌NO、ET-1的作用。

研究結果表明，RIMVECs是LLO作用的主要靶細胞，且CS可通過保護RIMVECs的增殖、調控LLO誘導的RIMVECs分泌NO、ET-1及mRNA表達。CS具有緩解LLO導致RIMVECs損傷的功效，將為后續的抗菌中藥成分方劑研發提供一定理論依據。

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(編輯：李文平)

Effects of Chondroitin Sulfate on the Secretion of NO and ET-1 in Rat Intestinal Mucosa Microvascular Endothelial Cells Induced by LLO

CHEN Xi1，MU Xiang2*, XU Jian-qin3*

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;3.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100094,China)

The purpose of this study was to investigate the treatment mechanism of the chondroitin sulfate (CS) on the listeriosis and the secretion of NO and ET-1 in rat intestinal mucosa microvascular endothelial cells (RIMVECs) induced by listeriolysin O (LLO).RIMVECs in culture were divided into LLO+CS, LLO, CS and blank control groups.Cells were assessed proliferation by MTT assay.The Changes of NO and ET-1 level were measured by the method of nitratase, ELISA and hybridizationinsitu.Compared with other groups, proliferation of LLO group was very significantly decreased.The production of NO and ET-1 were enhanced for 12 h, and NO/ET-1 ratio was lower.CS could regulate imbalance of NO/ET-1 induced by LLO and improve the local microcirculation of intestine.

chondroitin sulfate；intestinal mucosa microvascular endothelial cells；NO；ET-1；LLO

北京市自然科學基金A類重點項目(6061001)；北京市教委人才強教“學術創新團隊”中藥方劑研究(5090245)

陳希，博士，從事中獸藥相關方面研究。

穆祥,E-mail: muxiang1109@sina.com；許劍琴,E-mail:jianqinxucau@126.com

2015-10-28

A

1002-1280 (2015) 11-0025-05

S853.74