血管緊張素Ⅱ協同LPS誘導巨噬細胞活化和凋亡的研究

李 妍，張宸豪，方 芳，王長文，陳 爽，李 強，趙良中，陳 為

（1.吉林醫藥學院檢驗學院，吉林 吉林132013；2.吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林 吉林132013；3.吉林醫藥學院基礎醫學院，吉林 吉林132013）

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）中重要的效應因子，與AngⅡ1型受體（AngⅡtype 1，AT1)結合可促進血管平滑肌收縮，參與血壓調節[1]。單核巨噬細胞也表達AT1，在AngⅡ誘導后，其Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）表達增加；而TLR4與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）結合可介導巨噬細胞活化信號轉導[2]。理論而言，AngⅡ可促進LPS對巨噬細胞的活化，但活化的免疫細胞，往往通過活化誘導的細胞凋亡（Activation induced cell death/apoptosis，AICD）來減少自身的數量[3]。本研究以小鼠巨噬細胞RAW264.7為模型，來深入研究AngⅡ預處理對LPS誘導巨噬細胞活化和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細胞RAW264.7凍存于液氮中。AngⅡ和LPS為Sigma公司產品；JC-1線粒體膜電位（Mitochondrialmembrane potential，MMP）檢測試劑盒（產品編號C2006）、ROS熒光探針雙氯熒光黃乙酸乙酯（Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)和pH值檢測探針5-羧基熒光素,二乙酰甲酯（2'，7'-bis-（2-carboxyethyl）-5-（and-6）-carboxyfluorescein，acetoxymethylester，BCECFAM），購自上海碧云天生物技術研究所；1640培養液，購自Gibco公司；小牛血清，購自Hyclone公司；Annexin-V-GFP凋亡檢測試劑盒，購自南京基凱生物技術有限公司；棗紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的抗小鼠TLR4抗體，購自Biolengend公司。

1.2 細胞培養和處理 含10%小牛血清1640培養液、5%CO2、飽和濕度和37℃下培養細胞，每周傳代2到3次。接種細胞于培養瓶，加入AngⅡ（0，40，80 μg/mL和160μg/mL）后，培養24 h；AngⅡ（0或80μg/mL）處理細胞8 h后，加入LPS（0和4μg/mL），繼續培養16 h。

1.3 TLR4表達分析 取5×105個細胞,懸于100 μL PBS，加入1μg PE標記抗TLR4抗體或陰性對照抗體，4℃下避光反應30min。PBS洗2次后用400μL的PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測PE熒光強度來代表TLR4表達變化。

1.4 活性氧檢測 取5×105個細胞，PBS洗滌2次，100μL PBS重懸細胞，加入DCFH-DA儲存液，至其終濃度為5μmol/L，混勻后在37℃避光反應30 min，PBS洗2次，400μL PBS重懸細胞，流式細胞儀分析。

1.5 細胞凋亡分析 取5×105個細胞，用PBS洗滌2次，取195μL結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin-V-GFP工作液，室溫下避光反應30 min；結合緩沖液洗滌細胞2次，400μL結合緩沖液重懸細胞，流式細胞儀分析。

1.6 線粒體膜電位分析 取5×105個細胞，按說明書所述方法配制JC-1染色工作液和染色緩沖液（冰沐保存）。用500μL JC-1染色工作液重懸細胞，37℃避光反應30min；離心吸棄上清，染色緩沖液洗滌細胞2次；500μL染色緩沖液重懸細胞，用流式細胞儀FL1通道（525 nm）檢測細胞所發射的熒光。

1.7 細胞內pH值分析 取5×105個細胞，重懸于200μL PBS，加入DCFH-DA儲存液至終濃度為2 μmol/L，37℃避光反應30min；PBS洗滌細胞2次；500μL染色緩沖液重懸細胞，用流式細胞儀FL1通道（525 nm）檢測細胞所發射的熒光。

2 結果

2.1 不同濃度AngⅡ對TLR4表達的影響 AngⅡ誘導24 h后，檢測TLR4表達，結果表明，AngⅡ以濃度依賴的方式上調巨噬細胞TLR4表達（圖1）。

圖1 AngⅡ對巨噬細胞TLR4表達的影響

2.2 AngⅡ和LPS對巨噬細胞凋亡的影響 AngⅡ和LPS作用后，Annexin-V-GFP染色后分析細胞凋亡，與LPS單獨作用比，AngⅡ預處理組細胞凋亡百分率顯著增加（圖2）。

圖2 AngⅡ和LPS對巨噬細胞凋亡的影響

JC-1是一種新型熒光探針，進入細胞后，其存在狀態和發射熒光與線粒體功能緊密聯系。線粒體功能正常時，JC-1主要聚集在線粒體基質，形成聚合物，發射紅色熒光；而在MMP較低時，JC-1主要以單體形式存在，發射綠色熒光。與對照組比較，4μg/mL的LPS單獨作用后JC-1單體的熒光略下降，反映LPS可活化巨噬細胞并對線粒體功能有一定增強效應；雖然AngⅡ單獨作用對MMP影響較小，但與LPS協同作用可導致線粒體功能顯著下降（表1）。

表1 AngⅡ和LPS對巨噬細胞MMP的影響

2.3 AngⅡ和LPS對巨噬細胞ROS的影響 熒光探針DCFH-DA進入細胞后被酯酶水解為DCFH，繼而被氧自由基氧化而生成DCF，檢測DCF發射熒光的強度值可代表細胞內ROS水平。與LPS單獨作用比較，AngⅡ和LPS聯合作用，細胞內ROS顯著增加（表2）。

表2 AngⅡ和LPS對巨噬細胞ROS的影響

2.4 AngⅡ和LPS對巨噬細胞內pH值的影響 接近中性時，BECEF可在被激發后發射綠色熒光（530 nm），其熒光強度隨pH值升高而增強，熒光強度減弱則指示pH值下降。分析結果表明，與對照組比較，LPS或AngⅡ均可導致巨噬細胞pH值略下降；與LPS單獨作用組比，AngⅡ和LPS協同作用組，細胞內pH值顯著降低（表3）。

表3 AngⅡ和LPS對巨噬細胞pH值的影響

3 討論

血管緊張素原在腎素和血管緊張素轉化酶（Angiotensin-converting enzyme）的作用下被轉換為AngⅡ，RAS通過AngⅡ與其受體AT1結合導致血管平滑肌收縮，調節血壓平衡[1]。嚴重創傷、失血性休克、燒傷等急性應激情況下，AngⅡ主要體現其對機體的保護性作用。有學者報道，上述疾病合并感染，尤其感染革蘭陰性菌后，內毒素對血管內皮的損傷作用嚴重；在創傷和燒傷等情況下，細菌感染還可導致肺損傷并危及生命[4-5]。體內和體外研究發現，AngⅡ和LPS可協同作用，參與血管內皮細胞和肺泡上皮細胞的損傷。有學者將上述機體急性應激情況下，內毒素致病性加重的現象稱為“二次打擊”[6]。LPS上調血管內皮細胞AT1表達，及AngⅡ促進肺泡上皮等TLR4表達可能是形成該現象的重要原因。

微炎癥（Microinflammation）是指以循環系統中炎性蛋白、炎癥性細胞因子輕度升高為特征的低強度、慢性炎癥狀態。單純微炎癥沒有明顯臨床癥狀，但常伴隨糖尿病、慢性腎病和長期血液透析患者存在。導致微炎癥的機制尚未明確，但血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）可能發揮重要作用。巨噬細胞在抗感染和炎癥進程中的角色復雜，一方面其活化可增強吞噬病原體效應，另一方面活化巨噬細胞通過釋放炎癥介質，參與組織損傷。T細胞可通過活化誘導的細胞凋亡（Activation induced cell death/apoptosis，AICD）來減少自身的數量，近年來有學者報道，活化的巨噬細胞也發生凋亡和壞死[3，7]。體內有吞噬功能的細胞（巨噬細胞和嗜中性粒細胞）被活化后，其細胞內溶酶體活性增強，而細胞內pH值下降。雖然溶酶體活性增強有利于殺傷病原體，但在細胞死亡后溶酶體酶的釋放往往導致正常組織損傷[8]。

TLR4結合LPS后可活化p38MAPK和NFκB等炎癥相關的信號。本研究表明，AngⅡ以濃度依賴方式上調小鼠巨噬細胞TLR4表達，而在AngⅡ與LPS協同誘導后，細胞內ROS含量顯著增加，pH值下降幅度也較LPS單獨作用組大，即AngⅡ對LPS活化巨噬細胞具有曾敏作用。同時發現，AngⅡ與LPS協同誘導后，細胞凋亡和導致線粒體功能損傷的效應也增強了。概括而言，血管緊張素Ⅱ可協同LPS誘導巨噬細胞活化，兩者聯合也增加了活化后巨噬細胞的凋亡。活化巨噬細胞釋放炎性介質和死亡巨噬細胞釋放溶酶體酶，但均參與炎癥急性期的組織損傷，因此，AngⅡ與LPS協同可導致體內發生嚴重的炎癥相關的組織損傷。近年來，慢性微炎癥狀態下，巨噬細胞參與組織器官纖維化、動脈硬化等的證據引起人們重視。本研究表明，AngⅡ對巨噬細胞感應LPS刺激具有“預致敏”的作用，提示在機體急性應激和慢性的微炎癥狀態下，均應適當拮抗AngⅡ的“預致敏”作用以減輕內毒素的致病性。

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