綿羊肺炎支原體p128基因序列分析及原核表達(dá)

馮旭飛，刀筱芳，張賢宇，李定霏，楊發(fā)龍

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都610041；2.成都市水生動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)站，四川 成都610071）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae）是引起綿羊、山羊特別是羔羊增生性間質(zhì)性肺炎的主要病原。此外，羊感染綿羊肺炎支原體后，對(duì)多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌以及副流感病毒等病原的易感性增加[1-3]。該病原在全球范圍內(nèi)均有分布，在我國(guó)流行也十分廣泛，給養(yǎng)羊業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。

粘附素是支原體主要的毒力因子和免疫原，其介導(dǎo)支原體對(duì)宿主靶細(xì)胞的粘附和致病過(guò)程，同時(shí)也可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。因此，支原體的粘附素已經(jīng)成為建立ELISA等血清學(xué)診斷技術(shù)和開(kāi)發(fā)重組亞單位疫苗的重要候選蛋白分子。Niang等人的研究已表明，綿羊肺炎支原體同樣可以粘附到呼吸道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致纖毛運(yùn)動(dòng)停滯，進(jìn)一步造成纖毛破壞和脫落[4]。但目前對(duì)綿羊肺炎支原體中與粘附功能相關(guān)的分子尚不清楚。基于16S rRNA基因和HSP70基因的遺傳進(jìn)化分析表明，綿羊肺炎支原體與豬肺炎支原體具有最為相近的親緣關(guān)系[5-6]。在豬肺炎支原體中，P97是最為重要的粘附素分子。P146是P97/P102家族成員之一，研究已表明其同樣可以粘附豬氣管纖毛，是另一重要的粘附分子，同時(shí)也是主要的免疫原之一[7]。在綿羊肺炎支原體SC01株基因組中[8]，經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)一編碼產(chǎn)物與豬肺炎支原體p146高度同源的基因，推測(cè)其編碼蛋白的分子量為128 ku，故暫命名為P128蛋白。為了深入研究該蛋白的功能，本研究在對(duì)其進(jìn)行基因序列分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了原核表達(dá)，旨在為下一步深入研究其功能以及開(kāi)發(fā)血清學(xué)診斷技術(shù)和亞單位疫苗提供有用的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及血清 綿羊肺炎支原體SC01株由本實(shí)驗(yàn)室（西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室）分離鑒定和保存；pMD19-T載體、TOP 10、JM109、Rosetta（DE 3），均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；pET-41 a（+）載體為Novagen公司產(chǎn)品；兔抗綿羊肺炎支原體SC01株陽(yáng)性血清及陰性血清均由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；AxyPrepTMDNAGel Extraction Kit、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit均為Axygen公司產(chǎn)品；Histrap HP重組蛋白純化柱為GE Healthcare公司產(chǎn)品；Immun-Star WesternC Chemiluminescence Kit為Bio-Rad公司產(chǎn)品。1.3 p128基因序列分析 核苷酸及氨基酸序列的同源性比較和分析采用NCBI的BLAST工具；蛋白跨膜區(qū)、信號(hào)肽及脂蛋白預(yù)測(cè)分別利用在線工具TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SigalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）以及（http：//www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）完成。抗原性分析采用在線分析站點(diǎn)（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）進(jìn)行。

1.4 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)綿羊肺炎支原體SC01株p128基因序列，采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)引物：p128 F/p128R，引物擴(kuò)增片段大小為546 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其序列如下：

P128 F：5′-CGGGATCCTTAATATTAGCATTGACC-3′（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)）；

P128 R：5′-CCCAAGCTTCACTAAAATCTGTT CTTCT-3′（下劃線為Hind III酶切位點(diǎn)）。

1.5 目的片段的PCR擴(kuò)增 采用常規(guī)酚/氯仿法提取綿羊肺炎支原體SC01株基因組DNA作為模板，利用上述引物P128 F/p128R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系為25μL，包含10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP（各2.5mmol/L）2μL、MgCl2（25mmol/L）2μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.125μL、DNA模板2μL用無(wú)菌水補(bǔ)足25μL。反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30 s，58℃45 s，72℃45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增的p128基因與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP 10，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序并將重組質(zhì)粒命名為pMDp128。將測(cè)序正確的pMD-p128以及pET-41（a+）載體分別用Bam H I和Hind III雙酶切，膠回收目的片段，連接轉(zhuǎn)化到JM109，經(jīng)菌液及PCR鑒定為陽(yáng)性的送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析 將上述鑒定正確的重組陽(yáng)性質(zhì)粒pET-41（a+）-p128轉(zhuǎn)化至表達(dá)工程菌E.coli Rosetta（DE3）中，挑選陽(yáng)性菌落接種到LB肉湯中培養(yǎng)至OD600nm為0.6后，加入0.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3 h，并采用超聲破碎儀進(jìn)行超聲裂解。用SDS-PAGE對(duì)重組蛋白表達(dá)情況及其可溶性進(jìn)行電泳分析。

1.8 Western-blot分析 按照包涵體純化方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，以1∶300稀釋的一抗（兔抗綿羊肺炎支原體陽(yáng)性血清）和1∶5 000稀釋的二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG）按照Western blot操作方法進(jìn)行重組蛋白的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 分子特征分析 對(duì)p128基因進(jìn)行序列分析結(jié)果表明，p128基因CDS全長(zhǎng)3 426 bp，G+C含量為31.03%，其中含3個(gè)TGA密碼子（在支原體基因組中上編碼色氨酸），分別位于1 999 bp、2 356 bp、2 740 bp堿基處。該基因共編碼1 141個(gè)氨基酸，核酸分子量為128 484.5，其蛋白分子量為127.95 kDa。經(jīng)BLAST比較分析，p128基因與豬肺炎支原體黏附素基因p146相似性最高，兩者間核苷酸序列的相似性為73%，氨基酸序列的相似性為53%。

TMHMM、SignlP 4.0和LipoP 1.0在線工具分析的結(jié)果表明，P128蛋白主要錨定于細(xì)胞膜外，在其N端7-29氨基酸之間，有一明顯的跨膜區(qū)螺旋（圖1），無(wú)非脂蛋白信號(hào)肽（圖2），在第23-24氨基酸之間出現(xiàn)一個(gè)脂蛋白信號(hào)肽酶裂解位點(diǎn)。抗原表位分析顯示，P128蛋白包含豐富的抗原表位，通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其包含35個(gè)可能的抗原表位。平均抗原趨向性為1.0075。

圖1 P128跨膜結(jié)構(gòu)分析

圖2 P128脂蛋白分析

2.2 綿羊肺炎支原體p128基因的擴(kuò)增結(jié)果 綿羊肺炎支原體p128基因的PCR擴(kuò)增片段在546 bp左右出現(xiàn)一條特異性條帶，該片段與預(yù)期的目的條帶大小相符，陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增（圖3）。

圖3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果一致，質(zhì)粒PCR擴(kuò)增獲得特異性條帶（圖4）表明表達(dá)載體構(gòu)建正確。

圖4 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

2.4 重組蛋白的表達(dá)和可溶性分析 對(duì)重組蛋白進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在50 ku～75 ku之間出現(xiàn)明顯的表達(dá)條帶，其大小與預(yù)期（54.83 ku）相符（圖5）；該重組蛋白以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)（圖6）。

2.5 Western-blot分析結(jié)果 Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明，重組蛋白可與綿羊肺炎支原體陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，而陰性血清無(wú)條帶（圖7）。表明P128蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖5 P128的誘導(dǎo)表達(dá)

圖6 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析及純化

圖7重組蛋白的Western blot分析

3 討論

與絲狀支原體簇成員等其他羊致病性支原體相比，綿羊肺炎支原體分子生物學(xué)特性方面的研究相對(duì)滯后，其毒力因子及重要免疫原蛋白的研究尚不夠深入。此前國(guó)內(nèi)外多個(gè)學(xué)者先后采用雙向電泳、SDS-PAGE以及免疫印跡等方法對(duì)綿羊肺炎支原體的免疫原蛋白組成和大小進(jìn)行了初步分析[9-10]。針對(duì)特定的功能蛋白和編碼基因及其結(jié)構(gòu)和功能的研究相對(duì)較少。

Bogema等人[7]對(duì)豬肺炎支原體p146進(jìn)行原核表達(dá)后獲得重組P146蛋白并進(jìn)行粘附試驗(yàn)，經(jīng)多次重復(fù)，證明P146是一個(gè)具有多種功能的粘附素；同時(shí)證實(shí)，P146蛋白可以與免疫動(dòng)物、耐過(guò)動(dòng)物以及人工感染動(dòng)物的血清均可以發(fā)生明顯的結(jié)合反應(yīng)，說(shuō)明在這些血清中存在P146的抗體，從而證明P146是良好的免疫原。本文對(duì)綿羊肺炎支原體p128基因序列的分析結(jié)果表明，P128蛋白的編碼基因與豬肺炎支原體粘附素蛋白P746的基因高度同源，兩者間核苷酸序列的相似性為73%，編碼氨基酸序列的相似性為53%，說(shuō)明p128為p146的直系同源基因。為研究該蛋白的功能，本研究對(duì)編碼綿羊肺炎支原體p128的部分基因片段進(jìn)行了克隆，并成功在大腸桿菌中以包涵體的形式得到表達(dá)。利用兔抗綿羊肺炎支原體全菌抗體進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示，純化得到的重組蛋白能與兔抗全菌抗體特異性結(jié)合，表明用綿羊肺炎支原體免疫家兔后，家兔能產(chǎn)生針對(duì)P128蛋白的抗體，提示P128是綿羊肺炎支原體的免疫原之一；這同時(shí)也說(shuō)明本研究所表達(dá)的重組蛋白可以作為抗原，在ELISA等綿羊肺炎支原體血清抗體檢測(cè)試劑盒的研制和亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但P128在綿羊肺炎支原體中是否也是參與粘附過(guò)程的一個(gè)粘附素有待進(jìn)一步的研究。

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