表達ILTV gB和UL32基因的重組雞痘病毒疫苗安全性及穩定性分析

徐美玉，趙 燁，朱發江，張圓圓，，趙紅玲，秦秀慧，張國中

[1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193；2.北京市畜牧總站，北京 朝陽100107；3.詩華諾康科技發展（北京）有限公司，北京 朝陽100016]

雞傳染性喉氣管炎（ILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）引起雞的一種急性上呼吸道傳染病，為危害養禽業的重要疫病之一。疫苗接種是防制本病的最好方法。ILTV滅活疫苗制備和運輸成本高，一般不用于實際生產。弱毒疫苗具有相對較好的免疫效果，但安全性較差，會伴隨一系列副作用[1-2]。基因工程疫苗，尤其是重組病毒載體疫苗的安全性好、毒副作用小等優點使其成為ILTV的疫苗研究的一個熱點。

表達ILTV gB和UL32基因的重組雞痘病毒疫苗以雞痘病毒作為載體，表達ILTV gB基因和UL32基因，經冷凍干燥制成。UL32蛋白是包裝糖蛋白，而gB蛋白是病毒感染所必需的主要免疫糖蛋白。gB基因和UL32基因的保守性都很高，gB基因是ILTV的主要的保護性抗原[3-4]。雞痘病毒作為較成熟的重組病毒疫苗載體，已成功用于多種病原保護性抗原的表達，并在接種機體后顯示出良好的免疫原性。

為了評估表達ILTV gB和UL32基因的重組雞痘病毒活疫苗Vectormune FP-LT的安全性與穩定性，我們通過一系列試驗對影響疫苗病毒的安全性與穩定性的指標進行了評估，為該載體疫苗的生產應用奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 疫苗、毒株和實驗動物 表達雞傳染性喉氣管炎病毒gB和UL32基因的重組雞痘病毒活疫苗（FP-LT）由美國詩華-百妙動物保健公司生產（批號為420-046）。雞痘強毒102株，購自中國獸醫藥品監察所；9～10日齡SPF雞胚和6～8周齡SPF雞，購自北京維通利華實驗動物有限公司；ILTV抗體檢測用試劑盒為BioChek產品，購自北京天之泰生物科技有限公司。

1.2 檢測引物 根據已發表傳染性喉氣管炎病毒UL32基因序列及雞痘病毒4b核心蛋白基因序列分別設計特異性引物，如表1所示。

表1 本研究PCR檢測用引物

1.3 雞痘強毒102株EID50的測定 雞痘強毒102株通過SPF雞胚絨毛尿囊膜傳代復壯，復壯病毒進行10-1～10-5稀釋分別接種10日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜，每一稀釋度接種5枚，接種后120 h觀察并統計記錄絨毛尿囊膜變化（水腫、出現明顯痘斑）情況，根據Reed-Muench法計算毒株EID50。

1.4 疫苗株的傳代 將6～8周齡SPF雞通過右側股腿部外側涂抹毛囊接種疫苗，每只0.03mL。接種后5 d，隨機選取2只接種部位痘腫皮膚，研磨后用含抗生素（青霉素、鏈霉素各1 000單位（μg/mL）的PBS制成10%乳劑，離心取上清0.03 mL，以同樣方法接種第2代雞，如此連續傳至第5代。每代疫苗接種后，每日觀察接種雞的臨床癥狀，直至接種后14 d。觀察完畢，將第2、3、4代雞做安樂死處理，對每代2只取樣的傳代雞進行剖檢觀察。第1代疫苗接種后定期撲殺取接種部位皮膚、氣管、肝臟、脾臟、腔上囊和腦，利用PCR方法檢測重組病毒存在情況。取第5代重組病毒利用PCR檢測ILTV UL32基因的變異情況。

1.5 攻毒試驗 第5代雞接種后14 d，對第1代、第5代接種雞以及同居雞通過左側股腿部毛囊涂抹方式攻擊雞痘強毒102株，攻毒劑量為103EID50/只。同時設立空白對照雞和攻毒對照雞（與第5代同日齡），攻毒后每日觀察記錄攻擊部位的反應，直至攻毒后21 d。

1.6 接種雞排毒情況和飼養環境中病毒的存在情況檢測 第1代雞疫苗接種后定期采集試驗組和對照組雞的泄殖腔拭子，在7 d和14 d采集環境中的糞便以及籠具內表面擦拭物進行重組雞痘病毒的分離，并采用PCR方法檢測FPV-4b基因的存在情況。

2 結果

2.1 雞痘強毒102株EID50的測定 將雞痘強毒102株經絨毛尿囊膜途徑接種SPF雞胚進行復壯，并測定復壯病毒的EID50為10-3.32/0.15mL，結果如表2所示。

表2 雞痘102株EID50測定結果

2.2 重組疫苗的安全性檢測 試驗雞接種每代疫苗后，均觀察到接種部位的正常疫苗反應（“痘發”），“痘發”從疫苗接種3 d出現，9 d開始逐漸恢復，至14 d完全恢復正常，此外未見其他臨床癥狀。對每代雞進行剖檢觀察，亦未見任何病理變化。各代接種雞接種部位“痘發”表現類似，第1代雞疫苗接種部位的觀察記錄結果如圖1所示。

2.3 重組病毒的穩定性 FP-LT疫苗經SPF雞連續傳代，除疫苗接種部位皮膚的正常反應外，各組傳代雞均未見任何異常表現，第5代傳代疫苗毒中ILTV UL32基因序列與原代相比未發生任何變異，表明疫苗具有良好的遺傳穩定性。利用SPF雞胚測定不同代次毒株的毒價，結果表明，各代次毒株毒價穩定，無毒力返強現象，結果如表3所示。

2.4 重組病毒在雞體內的分布及存留時間 PCR檢測結果表明，接種后疫苗毒主要分布在接種部位皮膚，至少在接種后14 d仍可從部分雞接種部位皮膚檢出，其他組織如肝臟、腦、氣管等未有病毒檢出，如表4所示。

圖1 第1代雞接種部位皮膚表現

表3 重組雞痘病毒FP-LT不同代次毒株毒價檢測

表4 重組病毒在雞體內的分布情況及存留時間

2.5 重組疫苗的攻毒保護情況 臨床觀察及PCR檢測結果表明，重組疫苗免疫雞對雞痘強毒102株攻擊具有較好的保護力，保護率均在90%以上（表5），而同居雞攻毒后沒有任何保護力，同居雞攻毒部位皮膚重組雞痘病毒PCR檢測結果如圖2所示。

表5 重組疫苗對雞痘的攻毒保護結果

2.6 免疫雞排毒及重組病毒在環境中的存活時間PCR和病毒分離結果表明，疫苗接種后3～5 d部分雞只存在短暫排毒現象，但環境監測表明，病毒在環境中存在時間極短，如表6所示。同居雞攻毒試驗、環境中重組病毒檢測結果表明，重組病毒不具備水平傳播能力。

表6 重組疫苗免疫雞排毒情況檢測

圖2 對照雞攻毒部位皮膚雞痘病毒PCR檢測結果

3 討論

禽痘病毒表達系統是繼痘苗病毒以后的又一種動物病毒表達系統。與痘苗病毒不同，禽痘病毒的宿主范圍很窄，對人和其他哺乳動物僅產生一過性感染，接種副作用小。目前，研究者已經構建了表達多種禽類傳染病病毒蛋白的重組禽痘病毒，其中以禽痘病毒作為載體表達NDV HN基因和F基因及H5亞型AIV的重組活載體疫苗已獲得美國農業部的生產許可證[5]。重組痘病毒在ILTV疫苗研制方面也受到了人們的普遍關注。作為基因工程活載體疫苗研制中應用極為廣泛的一種工具，雞痘病毒具有如下優點：（1）能針對外源基因產生體液免疫應答和細胞毒T細胞免疫應答，一次接種可以產生長時間的免疫力；（2）因為重組疫苗只含有病原微生物特定的抗原成分，動物免疫后可以將自然感染動物與免疫動物區分開來；（3）雞痘病毒很容易在雞胚成纖維細胞和雞胚皮膚細胞等一些禽源細胞系上增殖，生產成本低廉；（4）痘病毒對熱穩定．易于保藏和運輸，不需要佐劑，不需要純化[6]。

本研究對表達ILTV gB和UL32基因的重組雞痘病毒活疫苗的安全性和穩定性進行了評估。結果表明，重組雞痘病毒疫苗經SPF雞多次傳代后外源基因序列無任何變異，各代次毒株毒價穩定，無毒力返強現象，表明該疫苗具有良好的遺傳穩定性。對試驗雞進行攻毒，重組病毒免疫雞能抵抗雞痘強毒102株攻擊，表明該疫苗具有較好的保護力。對接種雞體內及環境中重組病毒檢測結果顯示，病毒在接種雞體內各臟器及環境中存在時間極短，且同居雞未被感染，表明重組病毒不具有水平傳播能力，不會對環境造成污染，表明該疫苗具有良好的安全性。本研究對影響疫苗病毒的安全性與穩定性的指標進行了評估，為該載體疫苗在養禽生產中的應用奠定了基礎。

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