γ射線對(duì)紅細(xì)胞輻照時(shí)機(jī)及輻照后保存的研究分析

γ射線對(duì)紅細(xì)胞輻照時(shí)機(jī)及輻照后保存的研究分析

曹榮祎，蘇適，于洪敏，齊哲，劉鳳華*

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 輸血科，黑龍江 哈爾濱150001)

輸血相關(guān)性移植物抗宿主病(TA-GVHD)：是指患者自身不能清除輸入血液中有活性的淋巴細(xì)胞，其在患者體內(nèi)增殖，將患者的組織器官作為靶目標(biāo)進(jìn)行免疫攻擊、破壞的一種致命性輸血并發(fā)癥[1]。現(xiàn)在普遍被接受的是用γ射線對(duì)血液制品進(jìn)行照射，輻照血是預(yù)防輸血相關(guān)性移植物抗宿主病(TA-GVHD)的唯一有效方法[2,3]。隨著輸血醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)輸血診療技術(shù)的掌握，輻照血液制品的應(yīng)用在逐步的增加[4,5]。但是至今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)輻照血液的質(zhì)量和要求并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，到底什么標(biāo)準(zhǔn)的劑量既可以預(yù)防輸血相關(guān)性移植物抗宿主病(TA-GVHD)，又可以保持血液的正常功能，目前尚不明確。所以來探討γ射線對(duì)紅細(xì)胞輻照時(shí)機(jī)及輻照后保存的研究分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1儀器與材料新鮮全血取自健康志愿者，枸醛酸抗凝，湖北省八峰藥化股份有限公司宜昌分公司的一次性去白細(xì)胞采輸血器(規(guī)格：400 ml三聯(lián)袋，Ⅲ號(hào)抗凝液)和一次性塑料轉(zhuǎn)移袋(規(guī)格：50 ml)，加拿大諾迪安Gammacell 3000 Elan血液輻照儀(放射源為137Cs),美國(guó) Medica公司的Easylyte PLUS電解質(zhì)分析儀,上海分析儀器總廠的722型可見光分光光度計(jì)，Roche公司的2，3-DPG 試劑盒,南京建成公司的 ATP試劑盒，北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司的血漿游高血紅蛋白試劑盒。

1.2檢測(cè)指標(biāo)檢測(cè)2,3-DPG的含量、ATP含量、游離血紅蛋白含量、K+的含量和紅細(xì)胞滲透脆性的變化。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本的采集、輻照：首先，抽取全血10袋，全血為使用一次性去白細(xì)胞輸血器所采集。然后將其在24小時(shí)內(nèi)制備成懸浮紅細(xì)胞，在無菌操作下將懸浮紅細(xì)胞分裝于6個(gè)一次性塑料轉(zhuǎn)移袋內(nèi)，每袋約40 ml，隨機(jī)分成6組，分別標(biāo)記為對(duì)照組，第0 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d輻照組。做好標(biāo)記后，將所有樣本置于溫度為4±2℃下保存。對(duì)照組不進(jìn)行輻照，第0 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d輻照組分別在保存期的0 d、7 d、14 d、21 d、28 d經(jīng)行25Gy輻照劑量γ射線輻照。對(duì)照組在保存期取樣測(cè)定紅細(xì)胞活性與功能，第0 d輻照組在輻照后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d取樣測(cè)定紅細(xì)胞活性與功能，其余4組在輻照后0 d開始取樣測(cè)定，并且每隔7d分別取樣測(cè)定紅細(xì)胞活性與功能，此測(cè)定操作延續(xù)到第35天。

1.3.2檢測(cè)2,3-DPG的含量Roche公司的2，3-DPG 試劑盒，并按照說明書來操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3檢測(cè)ATP含量南京建成公司的 ATP試劑盒，并按照說明書來操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4檢測(cè)游離血紅蛋白含量采用鄰聯(lián)甲苯胺法測(cè)定，具體操作按試劑盒說明書來操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5檢測(cè)K+的含量采用電極法測(cè)定K+含量，按照Easylyte PLUS電解質(zhì)分析儀的說明書來操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6檢測(cè)紅細(xì)胞滲透脆性的變化采用Sanford法[6]測(cè)定紅細(xì)胞滲透脆性。

2結(jié)果

2.1檢測(cè)不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞的2,3-DPG含量變化:在輻照后繼續(xù)保存的過程中，可以看到各組的2,3-DPG的含量是逐漸減少的，但與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間段相比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.2檢測(cè)不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞的ATP含量變化第0d輻照組所有保存時(shí)段的ATP含量，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第7d輻照組采血后保存的第7天起，所有保存時(shí)段的ATP含量，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第14d輻照組在采血后保存的第14d、21d、28d，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第35d與對(duì)照組相比，ATP含量為對(duì)照組相應(yīng)保存時(shí)段的78.8%(P=0.032)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第21d輻照組在采血后保存的第21d、第28天、第35d，分別為對(duì)照組相應(yīng)保存時(shí)段的ATP含量相比較，分別為83.6%(P=0.035)、78.8%(P=0.031)、72.6%(P=0.029)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第28天輻照組在采血后保存時(shí)間的第28d、35d，分別與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的ATP相比較，分別為67.9%(P=0.024)、61.7%(P=0.021)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1　不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞的2,3-DPG含量變化

表2　不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞的ATP含量變化

注：與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間相比較*P<0.05。

2.3檢測(cè)不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞的游離血紅蛋白含量第7 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的游離血紅蛋白含量相比較(P=0.042)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第14 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的游離血紅蛋白含量相比較(P=0.038)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第21 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第21 d、第28 d、第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的游離血紅蛋白含量相比較(分別為P=0.025、P=0.029、P=0.030)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第28 d輻照組在采血后保存時(shí)間第28 d、第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的游離血紅蛋白含量相比較(分別為P=0.036、P=0.044)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3　不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞的游離血紅蛋白含量±s，g/L)(n=10)

注：與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間相比較*P<0.05。

2.4紅細(xì)胞滲透脆性變化實(shí)驗(yàn)

2.4.1不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞滲透脆性變化-開始溶血時(shí)的NaCl濃度：第7d輻照組在采血后保存時(shí)間的第28 d和第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的NaCl溶液濃度相比，明顯高于對(duì)照組(P=0.048、P=0.032)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第14 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的NaCl溶液濃度相比，明顯高于對(duì)照組(P=0.035)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第21 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第28 d和第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的NaCl溶液濃度相比，明顯高于對(duì)照組(P=0.047、P=0.030)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第28 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的NaCl溶液濃度相比，明顯高于對(duì)照組(P=0.023)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4　不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞滲透脆性變化-開始溶血時(shí)的NaCl濃度±s，%)(n=10)

注：與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間相比較*P<0.05。

2.4.2不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞透脆性變化-完全溶血時(shí)的NaCl濃度：第14 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的NaCl溶液濃度相比，明顯高于對(duì)照組(P=0.047)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第21 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第28 d和第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的NaCl溶液濃度相比，明顯高于對(duì)照組(P=0.041、P=0.032)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第28 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第35d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的NaCl溶液濃度相比，明顯高于對(duì)照組(P=0.043)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5　不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞透脆性變化-完全溶血時(shí)的NaCl濃度±s，%)(n=10)

注：與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間相比較*P<0.05。

2.5不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞游離K+含量變化各輻照組在輻照當(dāng)天與對(duì)照組的游離K+含量相比，差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各輻照組在輻照7 d的K+含量迅速升高，而且在7 d后的所有時(shí)間段的K+含量均高于對(duì)照組的相應(yīng)時(shí)間段，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6　不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞游離K+含量變化

3討論

近年來，患者輸注γ射線輻照過的血液的比例日益增高，國(guó)外一些國(guó)家輸注γ射線輻照過的血液應(yīng)用率高達(dá)95%，而目前在國(guó)內(nèi)還在推廣階段[7，8]。所以探討紅細(xì)胞的最佳輻照時(shí)機(jī)和被輻照后的保存時(shí)間，對(duì)輸注γ射線輻照過的血液的臨床應(yīng)用具有重要參考價(jià)值。

本研究中選擇取樣檢測(cè)ATP、游離血紅蛋白作為研究指標(biāo)，是基于以下原因：①紅細(xì)胞溶血率是紅細(xì)胞受到破壞后，衡量溶血程度的一個(gè)指標(biāo)[9，10]。②ATP是紅細(xì)胞代謝的基本能量來源，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度與活細(xì)胞密切相關(guān)[10，11]。以上這兩項(xiàng)是預(yù)期輸注紅細(xì)胞存活與功能比較有價(jià)值的參數(shù)。

在高蕾[12]等的研究中，我們可以看到:γ射線輻照血液及它所含成分，能有效地抑制淋巴細(xì)胞活化增殖，預(yù)防輸血相關(guān)性移植物抗宿主病(TA-GVHD)，并升高血紅蛋白含量，增加機(jī)體攜氧能力，提高患者體內(nèi)所需血液成分，增加其機(jī)體的功能，以便達(dá)到輸血治療的目的。

從本次研究的結(jié)果來看，在輻照后繼續(xù)保存的過程中可以看到：各組的2,3-DPG的含量逐漸減少，但與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間段相比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。表明不同的輻照處理對(duì)紅細(xì)胞的攜氧能力沒有明顯影響。在檢測(cè)不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞的ATP含量變化時(shí)可以看到：第0d輻照組所有保存時(shí)段的ATP含量，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第7d輻照組采血后保存的第7天起，所有保存時(shí)段的ATP含量，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第14 d輻照組在采血后保存的第14 d、21 d、28 d，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第35d與對(duì)照組相比，ATP含量為對(duì)照組相應(yīng)保存時(shí)段的78.8%(P=0.032)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第21 d輻照組在采血后保存的第21 d、第28天、第35 d，分別為對(duì)照組相應(yīng)保存時(shí)段的ATP含量相比較，分別為83.6%(P=0.035)、78.8%(P=0.031)、72.6%(P=0.029)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第28天輻照組在采血后保存時(shí)間的第28 d、35 d，分別與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的ATP相比較，分別為67.9%(P=0.024)、61.7%(P=0.021)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明ATP與輻照機(jī)制有關(guān)，紅細(xì)胞在受輻照后，其活性受到一定程度的影響。在本研究中，檢測(cè)不同保存時(shí)間輻照后紅細(xì)胞的游離血紅蛋白含量，我們可以看到：第7 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的游離血紅蛋白含量相比較(P=0.042)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第14d輻照組在采血后保存時(shí)間的第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的游離血紅蛋白含量相比較(P=0.038)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第21 d輻照組在采血后保存時(shí)間的第21 d、第28 d、第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的游離血紅蛋白含量相比較(分別為P=0.025、P=0.029、P=0.030)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第28 d輻照組在采血后保存時(shí)間第28 d、第35 d，與對(duì)照組相應(yīng)時(shí)段的游離血紅蛋白含量相比較(分別為P=0.036、P=0.044)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不僅僅游離血紅蛋白含量升高了，而且輻照后紅細(xì)胞游離K+含量也升高了，說明紅細(xì)胞受到一定程度的破壞。因此對(duì)于嬰兒、腎衰患者等不能耐受高K+的患者，不宜輸注輻照后保存的紅細(xì)胞，而應(yīng)在紅細(xì)胞輻照后盡快輸注。

綜上所述，紅細(xì)胞輻照時(shí)機(jī)直接決定了輻照后保存的血液質(zhì)量及保存時(shí)間。采血后當(dāng)天輻照的紅細(xì)胞功能和活性不受輻照的影響，可繼續(xù)保存35天。因此建議將紅細(xì)胞輻照最佳時(shí)機(jī)設(shè)定為血液采集后14天內(nèi)，輻照后的血液可繼續(xù)保存14到21天。

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(收稿日期：2015-02-18)

作者簡(jiǎn)介：曹榮祎(1980-)，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：血液照射。

文章編號(hào)：1007-4287(2015)12-2082-05

*通訊作者