中國人胰腺導管內乳頭狀粘液性腫瘤B-RAF基因(V600E)突變的研究

中國人胰腺導管內乳頭狀粘液性腫瘤B-RAF基因(V600E)突變的研究

張曉鴿1a，趙建軍2a，王慶宇1b，楊蕾2b*

(1.吉林大學第二醫院 a電診科;b研究中心,吉林 長春130041；2.吉林大學中日聯誼醫院 a呼吸科；b內鏡中心)

胰腺導管內乳頭狀粘液性腫瘤(Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms of the Pancreas，IPMNs)是胰腺癌最重要及最常見的癌前病變之一,約占臨床診斷胰腺腫瘤的7%,占偶然發現的胰腺囊腫的50%[1，2]。IPMN分型包括伴輕度不典型增生、IPMN伴中度不典型增生、IPMN伴重度不典型增生及IPMN相關浸潤性;不同分型決定著患者的治療方案和預后[3，4]。目前診斷僅憑病理形態學很難做到IPMN病理診斷及鑒別診斷準確性。急需新的診斷方法以滿足臨床對于IPMN診斷的需要。當前對IPMN分子分型的研究成為熱點，希望從在IPMN發病過程中起重要作用的分子中選擇出對IPMN診斷與治療有重要意義的分子標志物[5]。

鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌性同源體B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf家族的一個成員。這些蛋白激酶是保守的信號轉導的膜結合小G蛋白Ras蛋白下游信號通路元件，RAS招募Raf蛋白至細胞膜并刺激使其被激活。活躍B-RAF然后激活第二蛋白激酶MEK，從而激活蛋白激酶ERK。一旦被激活，ERK可進入細胞核，通過磷酸化轉錄因子，調節相應生物學活動。該基因參與調節基因表達，細胞骨架重排，代謝反應和協調細胞外信號調節細胞增殖，分化，衰老，凋亡，血管生成[6]。BRAF在多種腫瘤存在突變，包括結直腸癌、惡性黑色素瘤、肺癌、甲狀腺癌、胰腺癌與肝癌均存在不同比例的突變[7-9]。BRAF其突變位點主要位于基因的第11與15外顯子，其中15外顯子第1799 位核苷酸上(T突變為 A)，導致其編碼的谷氨酸被纈氨酸取代(V600E)尤為重要，該突變可不依賴上游K-RAS的活性而激活下游通路，具有重要的生物學功能[9]。通過分析BRAF基因在IPMN病例的突變情況，探討相關臨床及病理特點與BRAF的基因突變有關聯，對評估IPMN惡性程度以及判定是否發生癌變具有重要意義。

1材料與方法

1.1標本資料

收集吉林大學中日聯誼醫院2012年1月至2014年12月所有的胰腺手術切除腫瘤，經兩位高級病理醫師重新閱片篩查。共篩查出IPMN 31例入組，IPMN入組標準:以下3條中符合任意1條均可入組。(1)通過檢體或者B超以及放射線等影像學檢查發現胰腺導管有擴張;(2)病理學檢查發現囊性擴張的導管內被覆粘液上皮,或壺腹部有粘液溢出;(3)通過檢體或者B超以及放射線等影像學檢查發現導管內具有乳頭狀增生的腫瘤,并伴導管擴張。擴張的導管直徑不小于1 cm。所有病理學類型及TNM分期均按照WHO標準。

1.2B-RAF基因(V600E)突變測序分析

獲取石蠟組織切片進過二甲苯脫蠟后，收集腫瘤組織，應用DNA提取試劑盒(FFPE gDNA miniPREP KIT,BIOMIGA)進行組織DNA提取.以提取的DNA為模板應用B-raf基因V600E突變檢測試劑盒(北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司)通過實時定量PCR儀(羅氏480)進行檢測。

1.3統計學分析

應用Fisher’s 卡方檢驗分析B-RAF基因突變與病理學指標之間關系，以P<0.05為有統計學差異。

2結果

2.1B-RAF基因(V600E)突變檢測判定

通過熒光定量PCR檢測可見同時出現內參擴增曲線以及檢測擴增曲線的為陽性結果，而只出現內參擴增曲線沒有檢測擴增曲線的為陰性結果，見圖1。

A圖顯示為B-RAF基因(V600E)未突變擴增曲線；B圖顯示為B-RAF基因(V600E)突變擴增曲線；

2.2IPMN病例基本信息以及基因突變情況

在31例IPMN病例中，男性16例(占51.61%)，女性15例(占48.39%)，平均年齡63.9歲；臨床病理分型為胃型15例(占48.39%)，腸型8例(占25.81%)，胰膽管型7例(占22.58%)，嗜酸細胞型1例(占3.22%);侵潤型7例(占22.58%)，非侵潤型24例(占77.42%)；高分化14例(占45.16%)，中度分化9例(占29.03%)低分化8例(占25.81%)；B-RAF基因突變為2例，占6.45%。具體結果見表1。

表1　IPMN病例基本信息以及B-RAF基因突變情況

23男74胃型否高胰頭—24男68胃型否高胰頭—25女53胃型否中胰頭—26女78腸型是低胰頭—27女56胰膽管型是中胰頭—28女48胃型否中胰頭和胰體—29女74胃型否中胰頭和胰體—30男72胃型否高胰頭—31男56腸型否高胰頭—

+：陽性；—：陰性

2.3B-RAF基因突變與IPMN 病理特點的關系

應用漸進卡方以及精確卡方統計方法評估B-RAF基因突變與IPMN 病理特點的關系，結果顯示B-RAF基因突變與臨床分型無關(P=0.062)； B-RAF基因突變的IPMN發生侵潤的頻率(100%)明顯高于未突變的IPMN(17.24%)(P=0.045)，B-RAF基因突變的IPMN低分化率(100%)明顯高于未突變的IPMN(31.03%)(P=0.046)，見表2。

表2　B-RAF基因突變與IPMN 病理特點的關系

*P<0.05

3討論

IPMN 是一種胰腺囊性疾病，在臨床相對少見，但有可能發展為癌性病變。雖然經過多年的研究，但由于臨床、病理等方面的特殊，目前對IPMN的認識不足，使其在診斷、治療方法均不相同。如能早期診斷及對其進行干預治療，則預后明顯提高。到目前為止IPMN的遺傳分析，揭示了在許多相同基因的異常改變常規導管腺癌，包括KRAS基因[10]TP53[11]和CDKN2A/p16基因[12]的突變。

B-RAF基因編碼的蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族，位于RAS信號下游，在促進細胞增殖方面發揮重要作用。其突變的熱點堿基在不同研究中不同。在對胰腺癌熱點基因突變的研究中，發現了在胰腺癌的樣本中存在B-RAF基因的突變，其主要突變為V600E[8]。而在其他腫瘤熱點突變基因篩查中，發現BRAF突變主要發生在核苷酸1850，基因第616密碼子改變，導致氨基酸從絲氨酸到苯丙氨酸(S616F)[8，9]。在以往對于B-RAF基因在IPMN樣本突變檢測中，只是觀察到了S616F突變，而沒有檢測到V600E突變[13-15]。

本研究通過熒光定量PCR技術檢測31例IPMN樣本的B-RAF基因V600E突變，結果檢測到2例樣本的突變，突變率為6.25%。通過評估B-RAF基因突變與IPMN 病理特點的關系，結果顯示B-RAF基因突變的IPMN發生侵潤的頻率明顯高于未突變的IPMN，B-RAF基因突變的IPMN分化程度明顯低于未突變的IPMN。說明B-RAF基因V600E突變可能是預測IPMN發生侵襲以及惡性程度的分子標志物。由于本研究病例數有限，只是初步探討該基因突變在IPMN發生的頻率以及與病理學聯系，在此研究基礎上應加大研究樣本數目，更加明確B-RAF基因V600E突變作為判定IPMN良惡性的分子標志。

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(收稿日期：2015-02-19)

文章編號：1007-4287(2015)12-2077-04

*通訊作者

基金項目：吉林省科技廳項目(201215074)