熒光定量PCR檢測miRNA-155在過敏性皮膚病中的應用研究

李　迎,畢連紅,宋玉國

(北華大學附屬醫院，吉林 吉林132011)

熒光定量PCR檢測miRNA-155在過敏性皮膚病中的應用研究

李迎,畢連紅,宋玉國*

(北華大學附屬醫院，吉林 吉林132011)

摘要：目的建立熒光定量PCR技術檢測外周血miRNA-155相對含量檢測方法，研究過敏性皮膚病患者外周血miRNA-155表達量與正常對照組的差異。方法利用miRNA分離純化盒提取外周血血漿中的miRNA，逆轉錄合成cDNA后，采用SYBR Green熒光染料法進行定量PCR檢測40例蕁麻疹患者、30例皮膚濕疹患者和30例健康對照組外周血中miRNA-155的表達含量。結果蕁麻疹患者外周血中的miRNA-155的表達水平明顯高于正常對照組((P<0.01)，也高于皮膚濕疹患者(P<0.05)；皮膚濕疹患者與正常對照組比較miRNA-155的表達水平無明顯差異(P>0.05)。結論熒光定量PCR技術檢測外周血miRNA-155相對含量有助于蕁麻疹的診斷，為進一步研究蕁麻疹的發病機制奠定實驗基礎。

關鍵詞：蕁麻疹；微小RNA；熒光定量PCR

(ChinJLabDiagn,2015,19:2036)

microRNAs(miRNAs)是一類由高等真核生物基因組編碼的微小RNA。miRNA不能翻譯成蛋白質，但有調控基因的功能[1]。miRNA具有龐大的數量，在人體內就已經發現1000種以上的miRNA，絕大多數參與正常的生理調節，少數參與疾病的發生發展過程。miR-155 是免疫系統最重要的miRNA 之一，在固有免疫應答[2]、適應性免疫應答[3，4]以及炎癥性疾病[5]中均發揮重要作用。miRNA的檢測方法較多，應用熒光定量PCR方法檢測血漿中miRNA是一種準確、快速的方法，且可達到定量目的。本文應用該方法定量檢測miRNA-155，并研究其在過敏性皮膚病中的應用價值。

1資料與方法

1.1研究對象

病例選自2014年1月至2015年4月期間，北華大學附屬醫院皮膚科就醫患者。其中蕁麻疹患者40例，男16例，女24例，年齡37.80±9.67歲；皮膚濕疹患者30例，男13例，女17例，年齡41.20±15.37歲。健康對照組選自北華大學附屬醫院體檢中心，共30例，男15例，女15例，年齡36.47±9.87歲，近期無明顯皮膚病及過敏性疾病。

1.2標本采集

清晨空腹采集靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝。常溫下離心，3 500 r/min,10 min。分離血漿檢測，不能及時檢測的血漿標本置-70℃冰箱保存，一周內檢測完畢。

1.3方法

1.3.1miRcute miRNA提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供。按試劑盒說明操作。

1.3.2miRNA 3＇末端進行加Ploy(A)尾 劑盒由北京天根生化科技有限公司提供，反應液組成見表1。

表1　Poly(A)加尾處理反應液體系

注：混勻，12 000 rpm離心30 s,37℃ 60 min

1.3.3cDNA合成按如下20 μl反應體系配置見表2。

表2　合成cDNA反應液體系

注：同上。

1.3.4實時熒光定量PCR檢測miRNA-155。PCR體系見表3。PCR條件：94℃預變性2 min；94℃30 s，60℃34 s，共45個循環；熒光采集點設在60℃34 s末。PCR結束后，以0.05℃/sec的速度開始升溫，直到升高至94℃，做熔解曲線分析。

表3　PCR反應液體系

1.4統計學分析

PCR可以檢測記錄每個反應管中每次循環所產生的熒光信號，將每次檢測到的熒光信號繪制成每個反應管的擴增曲線，當熒光強度達到一定閾值時，PCR儀記錄下此時的循環數，以此為基礎可以得到每個樣本的Ct值。采用相對定量法進行分析，以U6作為內參照，計算標本中miRNA-155的相對表達量。標本中的miRNA相對表達量的計算公式：RQ=2-△Ct，其中△Ct=CtmiR-155-CtU6。所得到的結果使用SPSS19.0軟件對所得結果進行分析，各組間的比較采用兩樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1PCR擴增曲線

圖1為miRNA-155的擴增曲線圖，曲線分為：熒光背景信號階段、指數擴增階段和平臺期。曲線為平滑的S型，說明操作準確，結果可信。

圖1　miRNA-155的擴增曲線圖

2.2熔解曲線分析

在以SYBR為染料的PCR反應中，只要有雙鏈形成就會產生熒光。由于無法判斷PCR產生的熒光是否為特異性產物所發出的熒光，所以在反應結束后需進行熔解曲線的分析。如圖2所示，熔解曲線圖僅有單一峰，而未出現多峰，表明擴增的目的基因為單一產物，未出現非特異性擴增，實驗結果可信。

圖2　熔解曲線

2.3各實驗組miRNA-155檢測結果分析

以U6作為內參照，標本中的miRNA相對表達量按公式：RQ=2-△Ct計算，其中△Ct=CtmiR-155-CtU6。相對表達量取對數后進行統計分析，結果見表4。

表4　三組miRNA-155相對表達量統計表

①與濕疹組比較，P<0.05；②與正常對照組比較，P<0.01；③與正常對照組比較，P>0.05

3討論

miRNA是單鏈小RNA，雖然不能翻譯成蛋白質，但是可以在轉錄后水平對蛋白質編碼基因的表達進行調控。在細胞的增殖、分化、信號轉導以及器官的發育過程中均可發揮重要作用[6,7]。隨著研究的不斷深入，發現miRNA與過敏性疾病的發病機制密切相關。Sonkoly[8]對皮膚免疫性疾病相關的miRNA進行篩選，在初步篩選出來的29個miRNA分子中挑選出miR-203、miR-146a、miR-21及miR-125b進行擴大樣本量的檢測，最終證實了miR-203在銀屑病患者皮損中表達水平升高并且與健康對照組及過敏組比較均有統計學意義。在眾多miRNA當中，miR-155 是免疫系統最主要的miRNA 之一，在活化的各種免疫細胞中表達普遍升高，廣泛參與固有免疫應答和適應性免疫應答。過敏性皮膚病是臨床上常見的免疫相關性疾病，miR-155在過敏性皮膚病的發生發展中的作用如何，是近年的研究熱點。2010年，Sonkoly[9]等又發表了一篇關于miR-155在蕁麻疹中的表達特征的文章，研究結果證實miR-155在蕁麻疹患者中的表達與對照組相比顯著升高并有統計學意義。本文應用實時熒光PCR技術定量檢測過敏性皮膚病中的和濕疹患者血漿中miRNA-155的相對表達量，以健康人作為對照組，研究miRNA-155檢測在過敏性皮膚病中的應用價值。在應用實時熒光PCR技術定量檢測miRNA-155的方法學研究中，通過全面評估PCR擴增曲線和熔解曲線，證實檢測結果準確，PCR產物特異。臨床應用研究結果證實，蕁麻疹和濕疹患者血漿中miRNA-155的相對表達量均顯著高于對照組，此結果與Sonkoly[9]報道的結果一致。本文研究結果還發現，蕁麻疹組血漿中miRNA-155的相對表達量高于濕疹患者組，此結果的臨床意義尚需擴大量進一步研究。

參考文獻：

[1]Lewis BP，Burge CB，Bartel DP．Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J]．Cell，2005，120(1):15.

[2]O’Connell RM，Taganov KD，Boldin MP，et al．MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104( 5):1604．

[3]Thai TH，Calado DP，Casola S，et al．Regulation of the germinal center response by microRNA-155[J]．Science，2007，316( 5824):604．

[4]Teng G，Hakimpour P，Landgraf P，et al．MicroRNA-155 is a negative regulator of activation-induced cytidine deaminase[J]．Immunity，2008，28(5):621．

[5]Xiao B，Liu Z，Li BS，et al．Induction of microRNA-155 during Helicobacter pylori infection and its negative regulatory role in the inflammatory response[J]．J Infect Dis，2009，200(6):916．

[6]He L,Hannon GJ.MicroRNAs:small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nat Rev Genet,2004,5(7):522.

[7]Miska EA.How microRNAs control cell ivision,differentiation and death[J].Curr Opin Genet Dev,2005,15(5):563.

[8]Sonkoly E，Wei T，Janson PC，et al．MicroRNAs：novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis[J].PLoS One，2007，2(7)：e610．

[9]Sonkoly E,Janson P,Majuri ML，et al．MiR-155 is overexpressed in patients with atopic dermatitis and modulates T-cell proliferative responses by targeting cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4[J].J Allergy Clin Immunol,2010,126(3):581.

Application of miRNA-155 Detection with Fluorescence Quantitative PCR Technique in Allergic DermatosisLIYing，BILian-hongSONGYu-guo.(BeihuaUniversityAffiliatedHospital,Jilin132011，China)

Abstract:ObjectiveTo use Fluorescence Quantitative PCR technique to detect the relative content of the miRNA-155 in peripheral blood,and study the differences of the expression quantity of the miRNA-155 in peripheral blood between allergic dermatosis patients and normal controls.MethodsUse miRNA separation and purification box to extract miRNA from peripheral blood plasma,after reverse transcription of cDNA,use SYBR Green method to carry on the quantitative PCR test to detect the expression quantity of the miRNA-155 in peripheral blood among 40 cases of urticaria patients,30 cases of eczema patients and 30 cases of healthy controls.ResultsThe expression level of miRNA-155 in peripheral blood of urticaria patients was significantly higher than that of the control group (P<0.01) and was also higher than that of eczema patients (P<0.05).There is no significant difference of the miRNA-155 expression level between eczema patients and normal control group (P>0.05).ConclusionThe detection of the relative content of the miRNA-155 in peripheral blood with Fluorescence Quantitative PCR technique is conductive to the diagnosis of urticaria,laying an experimental foundation for further study of the pathogenesis of urticaria.

Key words:urticaria;miRNA;fluorescence quantitative PCR

(收稿日期：2015-05-14)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R758.2

文章編號：1007-4287(2015)12-2036-03

*通訊作者

基金項目:吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(201339022)