實驗性自身免疫性腦脊髓炎鼠模型建立及其病理特點

張　健， 曾育琦， 張　靜， 康德勇， 黃天文， 陳曉春

實驗性自身免疫性腦脊髓炎鼠模型建立及其病理特點

張健1，2，3， 曾育琦1，2，3， 張靜2，3，4， 康德勇5， 黃天文1，2，3， 陳曉春1，3，4

摘要:目的建立髓鞘少突膠質細胞糖蛋白多肽(MOG35-55)誘發的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型，并觀察其病理特點。方法應用MOG35-55多肽加福氏完全佐劑皮下注射免疫雌性C56BL/6小鼠，觀察其臨床癥狀、病理改變及影像學變化。結果模型組小鼠發病時間為免疫后(12±4)d(8~16 d)，發病率83.3%，呈慢性單向過程；H-E染色模型鼠脊髓白質見大量炎癥細胞浸潤；羅克沙爾堅牢藍染色顯示，脊髓白質呈片狀髓鞘脫失；電鏡顯示，髓鞘內層呈板層剝脫，軸索腫脹,結構疏松；脊髓MRI檢查可見髓內斑片狀T2異常高信號。結論慢性EAE模型具有發病率高、死亡率低、模型穩定、重復性高、制作方便的特點，模型病理改變接近多發性硬化(MS)，是研究MS較為理想的動物模型。

關鍵詞:少突神經膠質/免疫學； 髓鞘； 糖蛋白類/免疫學； 腦脊髓炎，自身免疫性，實驗性； 模型，動物

2. 福建醫科大學 附屬協和醫院老年病科，福州350001；

3. 福建省老年醫學研究所，福州350001；

4. 福建省高校老化與變性病重點實驗室，福州350001；

5. 福建醫科大學 附屬協和醫院病理科，福州350001

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種病因不明的、主要累及中樞神經系統白質的慢性炎性脫髓鞘疾病。基于人體實驗所受的嚴格限制，研究者多用動物模型模擬MS發病機理并探討其治療方法。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)可以由特異性抗原主動免疫建立，也可以由髓鞘特異T細胞被動免疫建立。由于不同動物遺傳背景及自身抗原的不同，造成EAE模型的不均一性。髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)存在于髓鞘膜和少突膠質細胞最外層，具有高度的免疫原性，研究表明，MOG及抗MOG抗體在MS發病中起重要作用。本研究參考國外相關文獻的方法[1]，建立MOG誘導慢性EAE模型，為進一步研究MS奠定實驗動物基礎。

1材料與方法

1.1動物8~10周齡雌性C57BL/6小鼠[上海斯萊克實驗有限公司，許可證號SCXK(滬)2007-0005]，體質量約18~20 g，隨機分為磷酸鹽緩沖液(phosphate-bufferedsaline，PBS)對照組(n=8)和EAE模型組(n=12)。

1.2試劑鼠源MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由上海生物工程有限公司合成，采用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography, HPLC)純化，HPLC純度>98%。福氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)、百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、羅克沙爾堅牢藍染料(luxol fast blue, LFB)(美國Sigma公司)；滅活結核桿菌(mycobacterium tuberculosis, H37Ra)(美國Difco公司)。

1.3方法

1.3.1EAE模型建立模型組每只小鼠配制200 μL乳化劑(MOG35-55300 μg，MT 500 μg)，雙脅部皮下分4點注射免疫小鼠，每側2點，每點50 μL乳化液[1]。對照組直接將PBS與CFA乳化，雙脅部皮下分4點注射免疫小鼠。2組均于免疫的當日(0 d)及免疫48 h(第2 d)腹腔內注射400 ng PT。免疫后每天同一時間點對小鼠進行體質量測量及神經功能評分[2]：0為無癥狀；1為尾部癱瘓；2為小鼠共濟失調，后肢輕癱；3為雙后肢癱瘓；4為四肢癱瘓；5為死亡。

1.3.2組織病理學檢查小鼠在免疫誘導后第20 d(EAE高峰期)經3 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，快速眼球取血后，取30 mL 4 ℃預冷的4%多聚甲醛/0.1 mol·L-1PBS(pH=7.2)由左心室內灌注，冰面上快速取小鼠腰膨大；置于預冷的4%多聚甲醛/0.1 mol·L-1PBS 4 ℃固定24 h，脫水，浸蠟，固定，石蠟包埋，沿脊髓橫切面連續切片，切片厚5 μm，行H-E染色及LFB染色。

1.3.3透射電鏡檢查電鏡標本取材后經3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定數天(或數小時)(4 ℃)，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定1.5 h，PBS漂洗；70%酒精飽和醋酸鈾染液塊染，酒精-丙酮梯度脫水，環氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片80 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色5 min；在透射電鏡(EM 208型，荷蘭飛利浦公司)下觀察、攝影。

1.3.4磁共振成像采用7T超高場動物專用磁共振成像儀(PharmaScan 70/16 US In-vivo MRI System，德國Bruker公司)對小鼠行脊髓磁共振成像。參數：采用Turborare-T2加權系列，重復時間(TR)：4 772 ms；回波時間(ET)：75 ms；層厚：0.8 mm；間隔：0；矩陣(matrix)：256×256；視野(DFOV)：2.0 cm×2.0 cm；采集時間(Acq Tm)14.51 s。

2結果

2.1臨床癥狀小鼠于免疫后(12±4)d相繼發病，癥狀高峰期出現于免疫后(20±3)d，平臺期為免疫后(30±2)d，臨床表現為慢性單向病程(圖1)。小鼠于免疫后第2 d起出現體質量明顯下降，在隨后的1周內體質量呈上升趨勢，期間未出現運動功能障礙，臨床神經功能評分為0分。免疫12 d左右，伴隨體質量再次下降，小鼠陸續出現運動功能障礙，臨床神經功能評分上升。患病小鼠表現為精神萎糜，尾部張力消失，后肢或四肢癱瘓，大小便功能障礙，個別小鼠呼吸功能衰竭死亡。MOG35-55誘發由尾部向頭端發展的功能障礙，病程呈慢性進展型。

EAE:實驗性自身免疫性腦脊髓炎; PBS:磷酸鹽緩沖液.圖1　小鼠臨床神經功能評分Fig 1　Clinical score of mice

2.2病理學表現H-E染色顯示，EAE小鼠脊髓中炎癥細胞浸潤，病變以脊髓腰膨大為主，表現為淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，小血管周圍可見血管套形成。選取脊髓腰膨大進行連續切片，觀察前索、后索、雙側側索4個區域，根據評分標準評定EAE小鼠病理表現。結果顯示，EAE小鼠炎癥浸潤明顯重于PBS對照小鼠(圖2)。LFB染色顯示，炎癥浸潤區域，脊髓白質中可見大小不等片狀髓鞘脫失(圖3)。透射電鏡掃描見EAE組小鼠髓鞘內層呈板層剝脫，軸索腫脹結構疏松、淋巴細胞及膠質細胞增生、膠質細胞吞噬髓鞘碎片(圖4)。

A、A1：對照組，未見明顯的炎癥細胞；B、B1：模型組，見大量炎癥細胞浸潤.　A、B：×25；A1、B1：×400.圖2　脊髓腰膨大H-E染色Fig 2　H-E staining of spinal cords

A、A1：對照組，髓鞘結構清晰，無髓鞘脫失；B、B1：模型組，白質見大小不等斑片狀髓鞘脫失.　A、B：×25；A1、B1：×200.圖3　脊髓腰膨大LFB染色Fig 3　Luxol fast blue staining of spinal cords

2.3影像學改變動物磁共振成像顯示,模型組小鼠腰髓見長T2斑片狀異常信號(圖5)。

3討論

MS是一種免疫介導的中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病，是青年人致殘最常見的疾病之一[3-4]。MS的病因尚未明確，且由于臨床異質性，人們認識到遺傳及環境因素在MS中的作用機制還需進一步明確，自身免疫異常通常被認為是最主要的發病機制[5-6]。基于人體實驗所受的嚴格限制，研究者多用動物模型模擬MS以探討其發病機理和治療方法。目前世界上研究MS的主要動物模型為EAE模型[1]。EAE是由各種致腦炎抗原誘導各種易感動物產生的中樞神經系統白質脫髓鞘為特征的遲發型超敏反應性自身免疫性疾病。由于EAE模型具有與MS高度相似的臨床、生化、免疫及病理特征，是研究MS的理想模型。

A：正常髓鞘板狀結構清晰，軸索內細胞器豐富結構致密；B：模型鼠髓鞘內層板狀剝脫，軸索腫脹結構疏松；C：模型鼠淋巴細胞及膠質細胞浸潤；D：模型鼠膠質細胞吞噬髓鞘碎片.圖4　電鏡掃描結果Fig 4　Electron micrographs of spinal cords

A：對照組，正常脊髓MR；B：模型組，鼠腰髓T2加權系列見斑片狀長T2異常信號.圖5　小鼠磁共振成像結果Fig 5　Magnetic resonance (MR) scan of lumar spinal cords

目前誘導EAE鼠常用方法有髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)誘導PL/J小鼠、髓鞘脂質蛋白(myelin proteolipid protein, PLP)誘導SJL小鼠及MOG誘導C57BL/6小鼠等。MBP68-86肽可在Lewis大鼠誘導急性EAE，該模型僅有急性期，缺乏慢性復發性的臨床特征，模型以T細胞浸潤為主，脫髓鞘現象不明顯[7-8]。PLP139-151誘導SJL小鼠產生復發緩解型EAE與人類MS模型較為接近，模型表現髓鞘脫失與軸索損傷[1]。本研究所建立的模型為MOG35-55誘導C57BL/6小鼠產生的模型，屬慢性進展型，呈慢性單向病程，以持續中樞神經系統炎癥浸潤、髓鞘脫失及軸索損害為特征[9-11]。從本研究的H-E染色結果可看出,模型組有大量的炎癥細胞，LFB染色模型組的脊髓可見大量髓鞘脫失，電鏡下模型組可見髓鞘內層板狀剝脫，軸索腫脹結構疏松，淋巴細胞及膠質細胞浸潤，膠質細胞吞噬髓鞘碎片。

MOG是一種表達在中樞少突膠質細胞和髓鞘表面的跨膜蛋白，在體內含量雖少，卻具有高度的免疫原性[12-13]，是既能引起脫髓鞘抗體反應又能引起T細胞反應的中樞神經系統髓鞘蛋白成分[14]。近年，用MOG誘導的EAE漸成為國際上研究MS的主要模型，但該模型建立方法差異較大，臨床表現不一。不同片段MOG多肽免疫不同品系小鼠可誘發不同發病形式的EAE模型[15]。本研究采用MOG35-55免疫h1b品系C57BL/6小鼠，該品系小鼠國內來源較為廣泛，小鼠遺傳背景明確、相關檢測試劑豐富，與目前國內普遍采用Wistar、SD大鼠模型相比，更適合探討MS的發病機制，免疫后小鼠表現為由尾端向頭端發展的運動功能障礙，病程呈慢性進展，中樞神經系統病變主要位于脊髓，病理改變為脊髓白質炎性細胞浸潤、明顯髓鞘脫失及軸索損傷。實驗中探索性應用高磁場MRI(7.0T)觀察小鼠脊髓影像學改變，掃描于模型組小鼠頸腰段，T2加權像見斑片狀長異常信號，證實影像學變化不僅與組織病理學上病變相符合，而且與臨床實際患者的脊髓影像改變相吻合。為后期采用高磁場MRI觀察和隨訪疾病的活動性變化進行了有利的探索。

本實驗中復制的慢性EAE模型具有發病率高、死亡率低、模型穩定、重復性高、模型制作較為方便的特點，模型病理改變接近MS，是研究MS較為理想的動物模型。

參考文獻：

[1]Stromnes I M, Goverman J M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis[J].NatProtoc, 2006,1(4):1810-1819.

[2]Berard J L, Wolak K, Fournier S,etal. Characterization of relapsing-remitting and chronic forms of experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice[J].Glia, 2010,58(4):434-445.

[3]Sospedra M, Martin R. Immunology of multiple sclerosis[J].AnnuRevImmunol, 2005,23:683-747.

[4]Ramagopalan S V, Handel A E, Giovannoni G,etal. Relationship of UV exposure to prevalence of multiple sclerosis in England[J].Neurology, 2011,76(16):1410-1414.

[5]Mc Dowell T Y, Amr S, Langenberg P,etal. Time of birth, residential solar radiation and age at onset of multiple sclerosis[J].Neuroepidemiology, 2010,34(4):238-244.

[6]Keegan B M, Noseworthy J H. Multiple sclerosis[J].AnnuRevMed, 2002,53:285-302.

[7]Xu L Y, Yang J S, Link H,etal. A nitric oxide donor, ameliorates experimental allergic encephalomyelitis in Lewis rats in the incipient phase: the importance of the time window[J].Immunol, 2001,166(9):5810-5816.

[8]Terry R L, Ifergan I, Miller S D. Experimental autoimmune encephalomyelitis in mice [J].MethodsMolBio, 2014，102：363-375.

[9]Xiao B G, Wu X C, Yang J S,etal. Therapeutic potential of IFN-gamma-modified dendritic cells in acute and chronic experimental allergic encephalomyelitis[J].IntImmunol, 2004,16(1):13-22.

[10]Einstein D L, Galea E, Gavrilyuk V,etal. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists prevent experimental autoimmune encephalomyelitis[J].AnnNeurol, 2002,51(6):694-702.

[11]Iglesias A, Bauer J, Litzenburger T,etal. T- and B-cell responses to myelin oligodendrocyte glycoprotein in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis[J].Glia, 2001,36(2):220-234.

[12]Bernard C C, Johns T G, Slavin A,etal. Myelin oligodendrocyte glycoprotein: a novel candidate autoantigen in multiple sclerosis [J].MolMed(Berl), 1997,75(2):77-88.

[13]Stefferl A, Brehm U, Linington C. The myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG): a model for antibody-mediated demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis[J].NeuralTransmSuppl, 2000,7(58):123-133.

[14]Hjelmstrom P, Juedes A E, Ruddle N H. Cytokines and antibodies in myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental allergic encephalomyelitis[J].ResImmunol, 1998,149(9):794-804; discussion 847-798, 855-760.

[15]Shetty A, Gupta S G, Varrin-Doyer M,etal. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE[J].NeurolNeuroimmunolNeuroinflamm, 2014,1(2):e22.

(編輯：何佳鳳)

Mouse Models and the Pathological Characterization of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Induced by MOG35-55

ZHANG Jian1，2，3, ZENG Yuqi1，2，3, ZHANG Jing2，3，4, KANG Deyong5, HUANG Tianwen1，2，3, CHEN Xiaochun1，3，4

1. Department of Neurology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China;2. Department of Geriatrics, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China;3. Fujian Institute of Geriatrics, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China;4. Key Laboratory of Brain Aging and Neurodegenerative Disease, Fujian Key Laboratory of Molecular Neurology, Fujian Medical University,Fuzhou 350001, China;5. Department of Pathology, Fujian Medical University Union Hospital,Fuzhou 350001, China

ABSTRACT:ObjectiveTo establish mouse models of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by peptide myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) and study their pathological characterization.MethodsThe female EAE model of C57BL/6 mice (10~12 weeks) were immunized subcutaneously at four sites into the flanks with 300 μg of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide (MOG35-55) with the assistance of Complete Freund's Adjuvant(CFA) and Pertussis toxin (PTX).We observed the clinical symptoms, histopathologic changes and changes on magnetic resonance scan.ResultsThe experimental group developed the typical symptoms of EAE on (12±4) days after immunization with the incidence of 83.3% and showed a chronic monophasic course.There was a large number of inflammatory cells infiltration and demylination inthe lumbar spinal cord.Electron micrographs demonstrated a considerable amount of the myelin sheaths displayed loose, vacuoles and splitting.Intramedullary spinal MRI study showed patchy T2 hyperintensityin EAE mice.ConclusionOur study reports a MOG-induced EAE model that has a high incidence and its pathologic changes were similar to multiple sclerosis (MS), so it might be an ideal model for the research on MS.

KEY WORDS:oligodendroglia/immunology; myelin sheath; glycoproteins/immunology; encephalomyelitis, autoimmune, experimental; models, animal

通訊作者:陳曉春. Email: chenxc998@163.com

作者簡介:張健(1973-)，女，醫學博士，副主任醫師

基金項目:福建省臨床重點專科建設項目

收稿日期:2014-11-19

中圖分類號:R-332； R341.32； R392.11； R744.3； R971

文獻標志碼:A

文章編號:1672-4194(2015)01-0016-04

作者單位: 1. 福建醫科大學 附屬協和醫院神經內科，福州350001；