含依諾沙星微球的改性明膠膜的制備及體外釋藥性研究

吳宏霞， 林　媚

含依諾沙星微球的改性明膠膜的制備及體外釋藥性研究

吳宏霞1， 林媚2

摘要:目的制備含有依諾沙星微球的改性明膠膜，并研究其體外釋藥性。方法以乳化交聯法制備依諾沙星明膠微球，以微球粒徑、載藥量、包封率為指標，應用正交試驗優選微球的最佳制備工藝后，將載藥微球分散到改性明膠膜中，對比普通載藥膜測定其在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中的釋放性。結果以最優工藝制備的依諾沙星微球外觀圓整，分布均勻，平均粒徑為(3.04±0.25)μm，>80%微球粒徑分布在1～6 μm，微球平均載藥量為(11.8±1.02)%，平均包封率為(78.24±3.18)%，載藥微球膜和普通藥膜中依諾沙星累積釋放約80%各需96 h和8 h。結論依諾沙星微球制備工藝穩定可行，載藥微球改性明膠膜體外釋放緩慢，有望開發為具有長效抗菌效果的創傷性敷料。

關鍵詞:依諾沙星； 微球體； 明膠； 膜劑； 藥用制劑/代謝

天然生物材料明膠是由動物皮和骨所含有的膠原蛋白溫和斷裂后制得的大分子蛋白質，具有良好的生物相容性和生物降解性、促進細胞粘附和生長、止血促凝等優勢，在醫藥領域用途廣泛。明膠單獨或與其他材料復合制成創傷敷料也成為研究熱點[1-2]。由明膠等親水膠態微粒形成的水膠體類敷料含水量高，能保持創面濕潤。敷料與組織接觸時可發生水合作用，有效吸收傷口滲出液，具有清創、密閉創面作用[3]。此外，在明膠薄膜敷料中摻入抑菌劑、表皮生長因子等生物活性物質，可更好地發揮抗菌防腐及促進創面愈合作用[4-6]。研究表明，明膠作為創傷敷料的不足在于明膠膜質脆，力學性能差，限制了其廣泛應用，經交聯后可提高在生理條件下的抗吸水性、機械性能以及藥物緩釋性能[7-9]。

依諾沙星為第三代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣，組織穿透性好和毒性低等特點，臨床上多用于泌尿系統感染、傷寒、腸炎以及皮膚和軟組織感染的治療。筆者將依諾沙星制成明膠微球后分散于戊二醛交聯的明膠膜中，制成依諾沙星微球-改性明膠薄膜(簡稱載藥微球膜)，發揮微球和改性明膠薄膜的雙重控釋作用，長時間內維持創面的有效抑菌濃度，促進創面愈合，減少敷料更換次數，為開發具有長效抗菌效果的新創傷敷料提供了參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑依諾沙星(批號：20110916，國藥集團化學試劑有限公司);明膠(Type B，美國Sigma公司);戊二醛(25%)、Span 80、Tween 80(國藥集團化學試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。

1.1.2儀器熒光倒置可拍攝顯微鏡(IX70，日本奧林巴斯公司)；電子天平(BSA124S，北京賽多利斯儀器系統有限公司)；紫外分光光度計(UV-2000，尤柯上海有限公司)；高速臺式離心機(TGL-10B，上海安亭科學儀器廠)；精密增力電動攪拌器(JJ-1)及恒溫振蕩儀(SHA-B，常州國華電器有限公司)。

1.2方法

1.2.1乳化分散交聯法制備依諾沙星微球稱取依諾沙星適量，溶解于0.1 mol/L氫氧化鈉溶液3 mL中；將一定濃度的明膠溶液15 mL與依諾沙星溶液混勻保溫于50 ℃水浴中。攪拌下將水相逐滴加入含乳化劑(Span 80與Tween 80的混合乳化劑，HLB=4.5)的50 mL液體石蠟中，50 ℃水浴下乳化一定時間后改成冰浴，逐滴加入1%戊二醛2.5 mL攪拌固化3 h。將得到的混懸液高速離心，棄去上清液，得沉淀。用無水乙醚、異丙醇交替洗滌沉淀2次，真空干燥24 h，得淡黃色粉末狀固體微球。同法制備空白微球。

1.2.2正交設計優選微球處方根據預實驗及文獻查閱，以微球粒徑、包封率、載藥量為指標，選取對微球質量影響較大的4個因素，即明膠質量濃度(A)、攪拌速率(B)、乳化劑/油相比例(C)、乳化時間(D)，每個因素取3個水平，通過L9(34)正交設計優選制備工藝[9]。因素水平見表1。

1.2.3微球形態、粒徑的觀察與測定取少量微球，置于載玻片上，滴加少量液體石蠟分散，置于熒光倒置顯微鏡下觀察，拍攝分布在載玻片上5個以上不同區域的微球，并測量其粒徑，微球不少于500個，獲得微球的平均粒徑和粒徑分布圖。

表1　L9(34)正交實驗因素及水平表

A：明膠濃度；B：攪拌速率；C：乳化劑/油相；D：乳化時間.

1.2.4微球中藥物含量、包封率和載藥量的測定采用紫外分光光度法[10]，以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液溶解，再以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成依諾沙星系列濃度的溶液。依處方用量將輔料配制成溶液，各溶液于200～400 nm波長下進行紫外掃描，發現依諾沙星最大吸收波長為268 nm，且輔料無干擾，故選擇268 nm為檢測波長測定吸光度(A)。以A對濃度(C)線性回歸，計算回歸方程，作為藥物含量測定的依據。

微球中藥物含量及包封率測定方法：將載藥微球研成粉末，精確稱取粉末樣品，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，100 ℃回流1 h，以0.45 μm微孔濾膜過濾后，紫外測定濾液A。按下列式(1)和式(2)計算載藥量和包封率。

(1)載藥量=(微球中依諾沙星量/微球總重量)×100%

(2)包封率=(微球中依諾沙星量/所投依諾沙星總量)×100%

1.2.5載藥微球膜的制備精確稱取按優選工藝制備的依諾沙星干燥微球50 mg，置于10 mL PBS中，高速分散1 min，將1 g明膠粉末加入微球溶液中，于40 ℃磁力攪拌至明膠完全溶解，滴加5%的戊二醛溶液1 mL交聯[11]。待體系黏度開始變稠時，迅速倒入10 cm培養皿中靜置流平，明膠膠凝后，置于30 ℃烘箱恒溫干燥24 h。以同等含藥量的依諾沙星代替依諾沙星微球同法制成普通載藥膜，另制備不含藥物的空白微球膜作為對照。

1.2.6載藥微球膜的體外釋放性考察采用PBS釋放體系模擬體液環境，研究載藥微球膜作為皮膚用敷料在皮膚創傷表面的釋藥特性。采用動態透析法，精密稱取約200 mg載藥膜3份,置于盛有PBS(pH=7.4)10 mL的透析袋中，扎緊兩端，封口后置于含20 mL PBS溶液作為釋放液的帶蓋容器中，置恒溫水浴振蕩器中(37 ℃，50 r/min)。定時(1,2,4,8,10,24,48,72,96 h)取樣3 mL，立即過濾(0.45 μm)，同時補充3 mL新鮮的恒溫緩沖液，以空白微球膜釋放液為對照，268 nm處測定吸光度，根據標準曲線計算各時間點藥物濃度Ci，并依據式(3)計算各時間點藥物累積釋放百分率(Q)。同法測定普通載藥膜的藥物累積釋放百分率。

其中，Mt為t時間，藥物累積釋放總量；M0為初始載藥膜中藥物總量。

2結果

2.1藥物的標準曲線方程以紫外分光光度法在268 nm波長處測定系列濃度(C)、吸光度(A)，得到A與C的回歸方程為：A=0.093 2C-0.013 1，r=0.999 8，表明依諾沙星在2～20 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2微球工藝條件優選以微球的包封率(S1)、載藥量(S2)、平均粒徑(S3)等指標的求和值來衡量，求和值S=S1+S2-S3，S值越大，表明微球質量越好，同時考察微球圓整度和黏連性，實驗結果見表2和表3。由表2可知，四因素對微球質量的影響排序為：A>B>C>D。最佳處方為A2B3C2D2，即：明膠濃度為15%，攪拌速率為2 000 r/min；混合乳化劑的用量為4%，乳化時間為10 min。

按照最佳制備工藝條件重復制備依諾沙星微球3批，所得微球平均粒徑為(3.04±0.25)μm，平均載藥量為(11.8±1.02)%，平均包封率為(78.24±3.18)%。該結果優于正交試驗條件下的實驗結果，表明該工藝條件制備明膠微球穩定可行。

2.3微球形態按最優工藝制備的依諾沙星微球，肉眼觀察呈淡黃色粉末狀，光學顯微鏡下觀察，微球外形圓整，表面光滑，分散性好，粘連極少(圖1)。

圖1　依諾沙星微球顯微鏡圖(　×100)Fig 1　Optical micrograph of Enoxacin microspheres(　×100)

NOABCD包封率/%載藥量/%平均粒徑/μm綜合評分1111155.775.764.2557.282122267.198.535.1570.573133361.317.054.4663.904212363.169.315.1267.355223158.9010.634.3265.216231264.2111.753.7772.197313239.6012.638.2643.978321345.2111.558.3448.429332151.7312.906.5058.13K1191.75168.6177.47180.62K2204.75183.78196.05186.73K3150.10194.22173.08179.25K163.9256.2059.1660.21K268.2561.2665.3562.24K350.0364.7457.6959.75R18.228.547.662.49

表3　綜合評分方差分析

SS:離均差平方和；f:自由度；MS:均方；F:方差比；Fα:α水平的F臨界值；P:方差分析作出錯誤判斷的概率.

2.4微球粒徑大小及粒徑分布按照最佳工藝條件制備的依諾沙星明膠微球，平均粒徑為(3.04±0.25)μm，其中粒徑為1～6 μm的微球>80%，粒徑分布窄，基本符合正態分布(圖2)。

圖2　依諾沙星微球粒徑分布圖Fig 2　Diameter distribution of Enoxacin microspheres

2.5載藥微球膜的體外釋藥載藥微球膜中的依諾沙星的釋放分為2個過程：首先，依諾沙星從微球中擴散到溶脹后的明膠凝膠層；其次，依諾沙星從凝膠層擴散到緩沖溶液的介質中。普通載藥膜中藥物僅需從凝膠層擴散到介質中。

載藥微球膜和普通載藥膜的體外累積釋藥曲線見圖3。普通依諾沙星明膠膜釋藥迅速，8 h累積釋放百分率達到了80%。載藥微球膜初始釋藥較快，這主要是由微球表面的依諾沙星從凝膠層擴散到緩沖溶液介質中引起的突釋。大約10 h后突釋結束，藥物平穩而緩慢地釋放，96 h釋藥約80%，載藥微球膜具有比普通載藥膜更優越的釋放性能。

圖3　載藥微球膜體外累積釋放百分率Fig 3　Accumulated release curve of drug-loaded microsphere galetin film

3討論

正交設計優選工藝結果表明，明膠濃度對微球的質量影響最大。明膠濃度太低，載藥量偏低；過高濃度的明膠制備的微球圓整度較差，粒徑變大，包封率降低。微球的粒徑與分布很大程度上也受攪拌速度和乳化劑種類與用量的影響。在不產生過多泡沫的前提下，乳化過程中攪拌速度增加，微球粒徑變小且粒徑分布變窄。乳化劑用量過少，不足以降低表面張力，用量過大則與明膠形成混合膠束，致使戊二醛進入膠束中固化后形成形狀各異的雜質，影響微球的外觀和質量。本實驗中采用4%復合乳化劑獲得的微球圓整光滑、分散性好，粘連少，這可能是親水、親油性乳化劑形成的混合膜與油相和水相都有較強的親和力，可以兼顧這兩方面的需求。實驗表明，乳化時間對微球影響不是很大，當乳化時間足夠時，乳液分散均勻，微球粒徑小且分布窄。

進一步方差分析可知，在選取的因素水平下，僅明膠溶液濃度對微球質量有顯著影響，攪拌速度、乳化劑濃度影響不顯著。但數理統計證實，F檢驗只有當f較大時檢驗的靈敏度才高，正交試驗中，如果f≤5，計算的F值介于F0.1與F0.2之間的，因素對指標也有一定影響，標以△[12]。因此本實驗中，攪拌速度和乳化劑濃度對微球綜合評分仍有一定的影響。

在微粒給藥系統的質量評價中，包封率、載藥量和粒徑均是重要的考察項目。包封率越高，藥物利用率越高，為微球質量的主要評價指標；載藥量越高，同樣重量的微球中藥物含量越高；粒徑越小則表面積越大，釋放速度稍快而穩定，可防止因微球和明膠薄膜的雙重緩釋導致釋放過慢。本試驗中的這3個指標里，包封率的數值相對較大，直接加和求值S可體現出包封率的權重最大。S越大，則微球質量越好。

載藥微球膜的體外釋放受藥物擴散、聚合物的溶脹、水合、蝕解、生物降解等多種機制影響，本實驗在pH=7.4的PBS環境中沒有溶菌酶，不易發生降解、蝕解過程，故微球內藥物以擴散和聚合物水合、溶脹為主。明膠自身具有很強的吸水溶脹性，與戊二醛交聯后水溶性顯著下降，戊二醛的加入量與改性明膠的溶脹性密切相關，故微球和改性膜中的明膠的交聯程度直接影響著體外緩釋性能，藥物釋放速度與明膠交聯度的關系有待在后續實驗中進一步研究。

本研究通過正交試驗優化依諾沙星微球制備工藝，得到的微球粒徑均一，包封率高，工藝簡單穩定。將載藥微球包封依諾沙星后分散于改性明膠膜中制成的生物創傷敷料，不僅具有良好的生物相容性、較好的吸水性、透氣性和抗菌止血效果，且緩釋長達4 d以上，較普通載藥膜具有更優越的緩釋效果，可極大地延長藥效、減少敷料更換次數和提高患者順應性等，為開發新型的長效緩釋抗菌傷口敷料提供一定的參考。

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(編輯：何佳鳳)

Preparation of a Modified Gelatin Film with Enoxacin Microspheres and Release Behaviour in vitro

WU Hongxia1， LIN Mei2

1.Center for Comprehensive Experimental Pharmacy, Fujian Medical University,Fuzhou 350108, China;2.Department of Medicinal Chemistry,School of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

ABSTRACT:ObjectiveTo prepare a modified gelatin film with Enoxacin microspheres and to research its drug release in vitro.MethodsEnoxacin gelatin microspheres were prepared by using emulsion crosslinking method.The optimum technology conditions were selected by orthogonal design method, with the diameter of the microballoon drug-bearing amount, encapsulation rate as the indexes.The microspheres loaded Enoxacin were dispersed into modified gelatin film.The release properties were studied in comparison with unmodified drug-loaded filmin phosphate buffered solution (pH=7.4).ResultsThe optimally prepared Enoxacin microspheres were shaped spherical, evenly distributed with mean diameter of (3.04±0.25) μm.The diameters of 80% of the particles were 1～6 μm.The loading amount of Enoxacin was (11.8±1.02)% and the encapsulation efficiency was (78.24±3.18)%.96 hours and 8 hours were needed to reach the cumulative release of approximately 80% from microspheres film and unmodified drug film, respectively, in phosphate buffered solution.ConclusionsThe technology of Enoxacin microspheres was stable and feasible, and the gelatin film loaded microspheres showed sustained-release evidently in vitro.The modified gelatin film with Enoxacin microspheres has the hope of becoming a novel wound dressing with sustained-released antibacterial effect.

KEY WORDS:Enoxacin; microspheres; gelatin; membranae; pharmaceutical preparations/metabolism

作者簡介:吳宏霞(1977-)，女，講師，藥學碩士. Email: whxfmu@126.com

基金項目:福建省教育廳科技A類項目(JA13148)

收稿日期:2014-10-27

中圖分類號:R341.26； R451； R943.41； R977.6

文獻標志碼:A

文章編號:1672-4194(2015)01-0011-05

作者單位: 福建醫科大學 藥學院，福州 3501081.實驗中心；2.藥物化學系