補腦止癇散對癲癇大鼠腦組織相關細胞因子IL-2、IL-6蛋白表達的影響

馮鐵為，程為平，孫麗

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.大慶市龍南醫院，黑龍江 大慶 163453)

癲癇作為一種具有與免疫系統相關的神經系統疾病，已日漸成為影響人類健康的一大疾患。有研究發現在其發病過程中因諸多細胞因子參與了細胞免疫調節而致癇。中藥復方補腦止癇散由制首烏、石斛、天麻、僵蠶等組成。本實驗研究通過觀察中藥復方對致癇后大鼠細胞因子IL-2、IL-6的影響來觀察中藥復方治療癲癇的效果，為該方在臨床中對癲癇疾病的治療及預防提供重要的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 動物

實驗共用80只大鼠，均來自于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供的符合條件的健康雄性Wistar大鼠，體質量180～220g，自由攝食、飲水1周，隨機選取10只用于實驗中的空白對照組。其余70只用于戊四氮誘導大鼠致癇，待大鼠成功點燃后用于下一步實驗。

1.2 方法

1.2.1 分組

實驗共分6組。將致癇成功的大鼠隨機分成5組，分別為癲癇模型組、補腦止癇散低劑量治療組、補腦止癇散中劑量治療組、補腦止癇散高劑量治療組、丙戊酸鈉治療組，空白對照組。

1.2.2 受試藥物

中藥補腦止癇散(由制何首烏、石斛、天麻、僵蠶、全蝎、遠志、甘松七味中藥組成，各藥混合為末，藥材購于江陰天江藥業有限公司生產的顆粒劑);丙戊酸鈉緩釋片(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司);戊四氮(美國Sigma公司)。

1.2.3 給藥方法

實驗空白組和癲癇模型組給予一定量的生理鹽水灌胃，其他各治療組均給予相應的藥物灌胃治療。給予藥物的劑量按正常成人(70Kg)與大鼠給藥劑量系數(0.018)折算:丙戊酸鈉換算為灌胃劑量為157.5mg/kg，補腦止癇散高、中、低劑量組分別按1.6g/kg、0.8g/kg、0.4g/kg的標準配成溶液，每天上午選擇固定時段對大鼠進行灌胃給藥1次，連續灌胃6周。實驗期間各組均自由攝食、飲水。

1.3 觀察指標

采用免疫印跡(Western blot)的方法測定IL-2、IL-6的蛋白陽性表達。

在液氮冷凍條件下提取蛋白后，采用Bradford方法確定待測樣品的蛋白含量。將待測的樣品和樣品緩沖液按1∶5的比例混勻后放在水中煮，待水沸騰后煮至5min停止，放在室溫下冷卻備用。把電泳緩沖液倒入電泳裝置中，于100V電泳至溴酚蘭前沿到達分離膠底部0.5cm時，停止電泳。按照凝膠大小剪取適合的濾紙、PVDF膜，置于轉膜液中浸透。低溫60mA電轉移1～1.5h。取下纖維素膜，做好標記，將膜用TBST緩沖液洗3次。在避光的條件下，逐漸加入堿性磷酸酶的特異性底物溶液至出現清晰的特異性條帶后停止，然后立即將膜浸入到去離子水中，漂洗幾分鐘即可。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織中海馬IL-2蛋白光度比的比較

由表1可知，模型組IL-2蛋白陽性表達與正常對照組比較顯著增加(P＜0.01);中藥高、中、低劑量組、西藥組的IL-2蛋白陽性表達均明顯降低于模型組(P＜0.05)，但和空白組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

表1 各組大鼠腦組織中海馬IL-2蛋白光度比的比較()

表1 各組大鼠腦組織中海馬IL-2蛋白光度比的比較()

注:與空白組比較，※P＜0.01;與模型組比較，▲P＜0.05，★P＜0.01。

組別n IL-2/GAPDH空白組 10 1.0087±0.0847★模型組 10 1.7135±0.5261※西藥組 12 1.0212±0.0571▲中藥低劑量組 11 1.1571±0.2637▲中藥中劑量組 12 1.0542±0.1897▲中藥高劑量組 13 1.0324±0.1982▲

2.2 各組大鼠腦組織中海馬IL-6蛋白光度比的比較 見表2。

表2 各組大鼠腦組織中海馬IL-6蛋白光度比的比較()

表2 各組大鼠腦組織中海馬IL-6蛋白光度比的比較()

注:與空白組比較，※P＜0.01;與模型組比較，★P＜0.01。

組別n IL-6/GAPDH空白組 10 1.0178±0.0996★模型組 10 2.6378±0.0780※西藥組 12 1.6184±0.0753▲中藥低劑量組 11 2.6378±0.1041◆中藥中劑量組 12 1.6796±0.0896▲中藥高劑量組 13 1.5456±0.1027▲

由表2可知，模型組大鼠海馬區的IL-6蛋白陽性表達比空白組顯著增加(P＜0.01);中藥高、中劑量組、西藥組大鼠海馬區IL-6蛋白的陽性表達和模型組比較明顯降低，(P＜0.05);中藥低劑量組蛋白的陽性表達與模型組相比無明顯差異，統計學上無意義(P＞0.05)，從數值上看，西藥組與中藥高劑量組的療效無明顯差異。

3 討論

癲癇病是臨床常見的神經系統疾病之一，其發病特點為癥狀復雜，病程長，易反復發作。目前西醫控制癲癇的主要手段仍然是藥物治療，而癲癇患者需長期服藥，而多數的抗癲癇西藥均存在毒副作用，使得癲癇患者長期遭受疾病和藥物不良反應的雙重痛苦。中醫在治療癲癇病方面有著悠久的歷史，積累了豐富的經驗，能夠從人體的整體機能狀態出發，無論針對癲癇復雜的病理機制進行辨證治療還是辨病治療上均有其獨特的療效和優勢。

本課題根據博士后導師程為平教授30年的臨床經驗，結合傳統中醫理論，創立了以補腦益髓為主，熄風化痰開竅安神為輔的治療癲癇之方補腦止癇散。方中制何首烏為君藥，有補益精血、固精益腎、烏須之功效。《本草正義》載其“專入肝腎，補養真陰”。現代藥理學研究發現何首烏中含有GABA，并且含量較為可觀，可抑制癲癇的發生，并具有補肝腎及鎮靜安神和降血脂作用［1］;石斛具有益胃生津、滋陰清熱的功效。何首烏與石斛相配伍，能達到補益肝腎、填精補髓的功效;天麻可以熄風止痙、祛外風，通經絡，《開寶本草》云:天麻“主諸風濕痹，四肢拘攣，小兒風癇、驚氣……”。天麻有“治風之神藥”之稱，現代藥理學研究發現天麻的主要成份天麻素能抑制興奮性神經遞質Glu的釋放［2］。全蝎含蝎毒，現代藥理研究已證實全蝎含有的蝎毒是抗癲癇的主要有效部位，而且還有作用更強的抗癲癇肽(AEP)可從蝎毒中分離出來，而AEP的抗癲癇作用依賴于單胺類神經遞質的釋放［3］。僵蠶性平，可熄風止痙、祛風止痛、化痰散結，《本經》載其“主小兒驚癇……”因其既能熄風，又能化痰，故為臨床治療癲癇的常用藥。遠志具有安心益智、祛痰開竅的功效。現代藥理學研發究現遠志有鎮靜、抗驚厥、抗癡呆和腦保護(開竅)的作用［4］。《藥品化義》記有:遠志，“入心開竅，宣散之藥。凡痰涎伏心，壅塞心轉……暫以豁痰利竅，使心氣通，則神魂自寧也。”本品對癲癇諸癥具有既安神又開竅雙向調節之功。甘松辛甘、性溫，可行氣止痛、開郁醒脾安神。現代藥理學證明甘松能有效延長大鼠驚厥潛伏期，減少發作持續時間和次數，降低癇性發作程度，并且可以減少癲癇發作所造成的神經功能損傷、認知功能障礙［5-6］。甘松與遠志合用能安神止癇。全方七味藥共奏補腦益髓，熄風化痰開竅安神之效。

在中樞神經系統內有多種細胞因子，如IL-1、IL-2、IL-6、TNF等，均是由膠質細胞和神經元分泌的，這些細胞因子都可以參與到癲癇的放電活動中［7］。本次實驗通過對IL-2、IL-6兩種細胞因子的研究，發現中藥復方補腦止癇散可能是通過降低大鼠腦組織海馬區的IL-2、IL-6蛋白的含量，改變中樞神經系統的興奮性，抑制癲癇的發作，對腦神經起到保護和營養的作用的。

［1］徐凌川，張華，許昌盛.白首烏化學成分與藥理現代研究評述［J］.中醫藥學刊，2003，21(11):1893-1895.

［2］薛柳華，唐一鵬，洪慶濤，等.天麻素對谷氨酸致培養皮層神經細胞損傷的保護作用［J］.北京中醫藥大學學報，1999，22(1):39-40.

［3］于家琨，張景海，王起振，等.東亞鉗蝎毒抗癲癇肽作用機制研究［J］.沈陽藥學院學報，1993，10(1):55-59.

［4］李浩飛，方明月.五種養心安神中藥的抗驚厥作用［J］.中國醫藥導報，2008，5(28):19-20.

［5］丁莉，李新玲，邵良.甘松對青霉素致癇大鼠行為學表現及腦電圖的影響［J］.癲癇與神經電生理學雜志，2010，19(3):132-135.

［6］馮鐵為，程為平.中藥復方補腦止癇散對戊四氮致癇大鼠IFN-γ的實驗研究［J］.中醫藥學報，2015，43(5):38-39.

［7］Wang S，Cheng Q，Malike S，et al.Interleukin-1beta inhibits gamma-aminobutyric acid type A［GABA(A)］receptor current in culutured hippocampus neurons［J］.J-Pharmacol-Exp-Ther，2000，292(2):497-504.